厌氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)工艺具有高效节能、污泥产量少和无需外加碳源等显著优势，适用于高氨氮废水处理，如垃圾渗滤液、消化废水和养殖沼液等。但是ANAMMOX工艺的实际应用受限于ANAMMOX菌难以富集，其倍增时间长，细胞产率低。为强化ANAMMOX菌的富集，减少污泥流失，可利用填料的截留作用，构建ANAMMOX生物膜系统，有助于工艺启动。
ANAMMOX生物膜反应器填料包括：火山岩、沸石、活性炭、聚氨酯海绵、无纺布和聚乙烯填料等。Wang等的研究运行无纺布固定床反应器，经39d完成ANAMMOX启动，367d达到最大氮处理负荷10.3kg·(m3 ·d)-1，TN去除率90%。王钧等的研究以聚氨酯海绵作为ANAMMOX生物膜载体，经过73d成功启动反应器；稳定运行时，总无机氮去除率达到87.97%。
温度是影响ANAMMOX生物膜工艺运行的重要因素。有研究发现，ANAMMOX菌在10~55℃均有活性，最适温度30~40℃。曾涛涛的研究考察了火山岩ANAMMOX生物膜反应器常温下的脱氮效果，结果表明15℃下，进水氨氮ρ(NH4+-N)为190mg·L-1，进水氮容积负荷(NLR)为3.4~4.2kg·(m3 ·d)-1，总氮(TN)去除率为42%~55%；当温度升高至20~23℃，进水ρ(NH4+-N)为46~78mg·L-1，NLR为2.9~3.2kg·(m3 ·d)-1时，TN去除率可明显提高至75%左右。
如何实现常低温下ANAMMOX稳定脱氮是目前ANAMMOX工艺实际应用面临的问题。本文探讨了不同温度(35~15℃)条件下，无纺布与改性聚氨酯泡沫塑料填料(改性聚氨酯填料)序批式生物膜反应器(sequencebatchbiofilmreactor，SBBR)的脱氮效果和微生物群落变化，以期为ANAMMOX的实际应用提供基础。
1、材料与方法
1.1 试验装置
SBBR试验装置如图1所示。双层反应器内层直径80mm，高240mm，有效容积2L；外层与恒温水浴锅相连，控制内层反应温度。反应器用锡纸包裹以避免光照。
两组反应器分别采用无纺布填料和改性聚氨酯填料，填充比40%。无纺布填料材质为聚丙烯，购自深圳市昌泰无纺布有限公司。将无纺布裁剪为约7cm宽的条状，然后将无纺布条缠绕在反应器中央的填料棒上，细线扎紧固定。
改性聚氨酯填料为网状聚氨酯泡沫塑料(购自江苏艾勤环保科技有限公司)，将其切割为1.0cm3正方体块备用；采用低温等离子体技术对填料进行表面改性处理。用细线将填料块穿起并缠绕固定在反应器中央的填料棒上。
1.2 进水水质
进水成分主要包括： ρ236mg·L-1， ρ(NaNO2)296mg·L-1， ρ(MgSO4 ·7H2 O)300mg·L-1， ρ(NaHCO3)为500mg·L-1， ρ(CaCl2 ·2H2 O)为150mg·L-1， ρ(KH2PO4)为30mg·L-1；微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ各1mL·L-1.采用(1+9)HCl调节pH为7.5~7.8；为保持厌氧条件，进水曝高纯N2 15min，使反应器内DO降至0.3mg·L-1以下。
1.3 SBBR工艺启动与运行
1.3.1 接种污泥
无纺布和改性聚氨酯填料反应器均接种ANAMMOX污泥，接种污泥浓度为4000mg·L-1，进行挂膜。接种污泥取自1m3的SBR反应器，该反应器在25~30℃条件下运行，水力停留时间16h，进水ρ(TN)为500~800mg·L-1，出水ρ(TN)低于50mg·L-1，TN去除率在90%以上。
1.3.2 SBBR工艺启动
启动期，控制恒温35℃，启动ANAMMOX生物膜反应器。两反应器的进水NLR为110mg·(L·d)-1，其中ρ(NH4+-N)为50mg·L-1， ρ(NO2--N)为60mg·L-1.试验运行周期为24h：进水15min，反应时间23h，静沉30min，排水15min；排水比90%。稳定运行时，无纺布填料反应器的TN去除率长期处于60%~85%；改性聚氨酯填料反应器的TN去除率基本保持在80%以上。
1.3.3 运行
对已经成功启动并稳定运行一个月的无纺布填料和改性聚氨酯填料反应器进行降温试验，共5个阶段，温度梯度设置为35、30、25、20和15℃，每个温度条件下运行20~25d。温度变化时，分两次降温：第一次降温3℃，稳定3d后，再降温2℃至所需温度。
1.4 分析项目与检测方法
1.4.1 常规氮指标检测
每个试验运行周期结束时，取水样测定氮指标。NH4+-N、NO2--N和NO3--N均采用国家标准方法检测，TN为NH4+-N、NO2--N和NO3--N三者之和；pH和DO分别采用便携式pH计(Jenco，6010M，USA)和便携式溶解氧仪(Hach，HQ30d，USA)测定。
1.4.2 微生物群落结构和多样性分析方法
(1)DNA的提取在35、25和15℃稳定运行期间，剪取适量改性聚氨酯生物膜填料，与反应器出水一同置于50mL离心管中，保证填料被浸没。用多管振荡仪振荡10min至生物膜充分脱落。将泥水混合物在转速3000r·min-1下离心3min，弃去上清液，保留泥样提取DNA。采用土壤DNA提取试剂盒(OmegaBio-Tek，Inc。，Norcross，GA，USA)提取微生物基因组DNA。
(2)高通量测序对提取出的DNA进行qPCR检测。对所扩增的16SrRNA中的V3-V4区域，进行小片段基因文库的构建，并基于IlluminaHiSeq测序平台对该文库进行双末端测序。经过Reads拼接过滤，对所有样本的有效数据(effectivetags)，以97%的一致性(identity)进行OTUs(operationaltaxonomicunits)聚类，然后对OTUs的序列进行物种注释丰度分析，揭示样本的物种组成和群落结构的差异。
2、结果与讨论
2.1 不同温度下ANAMMOX生物膜工艺的脱氮效果
不同温度条件下，无纺布和改性聚氨酯泡沫塑料填料反应器进出水ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)和TN去除率见图2，化学计量系数变化如图3所示。
进水ρ(TN)为110mg·L-1时，在35、30、25、20和15℃运行期间，无纺布填料反应器TN平均去除率分别为71.16%、76.19%、75.15%、72.68%和61.11%，而改性聚氨酯填料反应器TN平均去除率分别为78.71%、80.16%、79.78%、81.75%和75.68%。
在降温过程中，无纺布填料反应器TN去除率在30℃时达到最大值76.19%，在35~20℃条件下均保持70%以上的TN去除率，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N在1.34~1.45之间，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N在0.42~0.51之间；降温至15℃时，TN去除率降低至61.11%，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N降至1.09，低于ANAMMOX反应理论值1.32，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N降至0.41，但仍高于ANAMMOX反应理论值0.26.化学计量系数与ANAMMOX反应理论值的偏差说明反应器中还存在其他氮转化的反应。ΔNO2--N∶ΔNH4+-N偏高说明系统中存在反硝化反应，偏低可能是由于硝化过程中的氨氧化或短程反硝化反应；ΔNO3--N∶ΔNH4+-N偏高说明有硝化反应中的亚硝酸盐氧化过程发生，偏低说明有全程或短程反硝化反应。可以看出，随着温度降低，无纺布填料反应器中的硝化反应增强，反硝化反应减弱。改性聚氨酯填料反应器在35~20℃条件下，TN去除率均保持80%左右；降温至15℃时，TN去除率降至75.68%，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N从1.23~1.41降至1.16，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N从0.28~0.33降至0.24；降温过程中，氨氧化和反硝化反应增强，亚硝酸盐氧化减弱。
这一现象与李祥等的研究结果相似：温度在26~37℃时，ANAMMOX生物膜反应器氮去除速率在1.51~1.84kg·(m3 ·d)-1之间，变化幅度4.35%，当温度低于20℃时，去除速率快速下降，尤其当温度低于15℃时，氮去除速率下降至0.55kg·(m3 ·d)-1，同时出现大量NO2--N积累。宋成康等实验运行SBR反应器，在20~33℃可稳定ANAMMOX脱氮，其中TN去除负荷稳定在0.4g·(L·d)-1左右；但当温度为15℃时，出现NO2--N积累。温度降低导致厌氧氨氧化活性下降和活化能提高，使ANAMMOX脱氮效率下降。
在相同温度条件下，与无纺布填料反应器相比，改性聚氨酯填料反应器TN去除率更高，化学计量系数更接近ANAMMOX理论值；在降温过程中，改性聚氨酯填料反应器TN去除率的下降幅度更小。可以看出，改性聚氨酯填料相对于无纺布填料能够达到更好的脱氮效果，同时对低温适应能力更强。这可能是因为改性聚氨酯填料的多孔结构更易形成并维持厌氧环境，从而更有利于ANAMMOX反应。因此，改性聚氨酯填料可以作为ANAMMOX生物膜工艺的优选填料；同时改性聚氨酯填料反应器75%以上的TN去除率也说明ANAMMOX生物膜工艺具有常低温下处理废水的潜力。
2.2 35、25和15℃条件下改性聚氨酯填料生物膜菌群分析
选取脱氮效果较好的改性聚氨酯填料反应器，分别在35、25和15℃稳定运行期间取3个平行泥样，检测其微生物群落的变化。
2.2.1 基于门水平的微生物群落分布
采用MiSeq高通量测序技术分析微生物的特异性DNA片段，根据OTUs序列的物种注释结果对菌群进行结构组成分析，得到不同温度条件下改性聚氨酯填料生物膜在门水平上的物种相对丰度如图4(a)所示。
结果表明，改性聚氨酯填料反应器中的主要微生物菌群包括浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)等。ANAMMOX菌所属的浮霉菌门(Planctomycetes)，在35、25和15℃的污泥样品中分别占33%、26%和41%，相对丰度最高。除此之外，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)在3个温度条件下的相对丰度也较高，分别占30%、19%和8%(35℃)，28%、22%和13%(25℃)，26%、10%和6%(15℃)。这几类相对丰度较高的细菌与ANAMMOX菌之间存在协同和竞争关系，同时得到富集，成为系统中的优势微生物。
2.2.2 基于属水平的微生物群落分布
由图4(b)可知，35℃和25℃下ANAMMOX菌属CandidatusKuenenia的相对丰度分别为8%和5%，而15℃条件下， CandidatusKuenenia的相对丰度达到16%，说明温度降低没有对功能菌的富集产生影响。从35℃到25℃功能菌相对丰度下降可能是因为短期内温度的下降对ANAMMOX菌活性产生了影响，导致增殖速度减缓，但由于CandidatusKuenenia对20℃以下环境温度的良好适应性，很快恢复了活性，实现了增殖，在15℃达到相对丰度最大值16%。降温过程对ANAMMOX菌利用基质的影响大于对增殖的影响，因此，15℃条件下虽然功能菌的丰度达到最大，但是脱氮能力弱于25℃和35℃条件下的脱氮能力。
Pseudomonas、Denitratisoma和Thauera等多个具有反硝化作用的属也在反应器中共存。其中Pseudomonas和Denitratisoma的相对丰度较高，在不同温度条件下的相对丰度分别为7.4%和1.9%(35℃)、3.4%和5.4%(25℃)、5.6%和7.4%(15℃)。与CandidatusKuenenia类似，反硝化菌属Pseudomonas在降温过程中出现了先适应，后恢复并增殖的现象。 Denitratisoma则比较适应低温的环境，随着温度的降低，相对丰度逐渐升高。系统中还存在硝化细菌，包括AOB属Nitrosomonas和NOB属unidentified_Nitrospiraceae。在温度从35℃降至25℃再到15℃的过程中， Nitrosomonas相对丰度从0.6%上升到1.2%，又降至1.0%； unidentified_Nitrospiraceae 相对丰度则持续下降，从0.61%到0.37%再到0.07%。
降温过程对不同脱氮细菌的活性影响不同。35、25和15℃条件下，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N和ΔNO3--N∶ΔNH4+-N分别为1.35和0.33、1.41和0.32、1.16和0.24.降温至25℃时，ΔNO2--N∶ΔNH4+-N有明显升高，但是ΔNO3--N∶ΔNH4+-N基本不变，两个化学计量系数又都高于ANAMMOX理论值，说明此时除ANAMMOX之外还发生亚硝酸盐氧化和反硝化反应，NOB和反硝化菌(denitrifyingbacteria，DNB)占据较大优势。继续降温至15℃时，ΔNO2--N∶ΔNH4+-N和ΔNO3--N∶ΔNH4+-N均降低且低于ANAMMOX理论值，说明此时发生的脱氮副反应主要为氨氧化和反硝化，AOB和DNB的优势大于NOB。化学计量系数和物种丰度变化都表明，降温过程对不同脱氮细菌的代谢和增殖产生了不同影响。
2.2.3微生物群落差异分析
为了比较不同温度下的微生物群落构成，将所有样本的物种注释结果和OTUs的丰度信息合并处理后，进行降维分析，从中发现不同样本间的差异。
对样品进行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)如图5(a)所示。从中可知，15、25和35℃条件下的生物膜群落构成有显著差异，且从各组之间的距离可以看出，各组间的差异程度相近。无度量多维标定法(non-metricmulti-dimensionalscaling，NMDS)分析能够克服PCA线性模型的缺点，更好地反映生态学数据的非线性结构。NMDS分析的结果见图5(b)，35℃条件下的生物膜菌群组成与其它两组差异较大，说明温度显著影响了生物膜群落结构。
3、结论
(1)在NLR为110mg·(L·d)-1，温度由35℃逐步降至15℃的过程中，无纺布填料反应器的平均TN去除率先由71.16%(35℃)提升至76.19%(30℃)后又降低至61.11%(15℃)，而改性聚氨酯泡沫塑料填料的平均TN去除率先由78.71%(35℃)提升至81.75%(20℃)后又降低至75.68%(15℃)。
(2)与无纺布填料反应器相比，在相同条件下，改性聚氨酯填料反应器的脱氮效果好于无纺布填料反应器，这说明改性聚氨酯填料反应器系统对温度波动的适应能力更强，更易在常低温环境下实现较好的脱氮效果。
(3)高通量测序结果表明，改性聚氨酯填料生物膜主要ANAMMOX菌属为CandidatusKuenenia，相对丰度分别为8%(35℃)、5%(25℃)和16%(15℃)，说明低温条件下， CandidatusKuenenia仍会增殖富集。温度显著影响了生物膜群落结构。（来源：天津大学环境科学与工程学院，济南城建集团有限公司）