我国的工业化和城市化的快速发展大大推动了国内污水处理厂的建设，随之而生的大量剩余活性污泥的无害化处置，成为了我国在未来必须面对的挑战。污泥中含有病原菌、抗生素、重金属等物质，若不妥善处理，会造成土地污染、地下水污染甚至大气污染等严重环境问题。但因为污泥中含有大量有机质，可作为生物质资源，因此欧美国家主要使用厌氧消化工艺对剩余污泥进行“无害化”“资源化”处理。但是，我国污泥含水量高（>80%）且含有大量沙石，严重限制了污泥厌氧发酵的产气效率。
近年的研究发现，通过一定的预处理手段能提高剩余污泥的甲烷产气率。目前常用的污泥预处理方式有物理、化学、生物法或者联合预处理法，均展现出了一定的应用前景：何顺通过热碱结合预处理污泥后与香蕉秸秆发酵，甲烷产率为183mL/g，相比未预处理时提高了3倍；Choi等通过热水解预处理使污泥累积产甲烷量提高了1.4倍；谢帅等发现，当剩余污泥和餐厨垃圾混合发酵时，各种预处理法对于混合发酵的促进作用大小为热处理＞超声处理＞碱处理。
相比于耗能巨大的热水解、工艺复杂的化学试剂添加等，生物预处理耗能低、操作简单，更重要的是不会产生难降解聚合物质，使得处理后的原料对产酸菌、产甲烷菌的毒性更低，有机质的甲烷转化率更高。生物预处理法包括酶处理和生物强化处理，通过淀粉酶、蛋白酶或产水解酶菌等，破坏大分子有机质的结构来提高污泥的降解率。但是酶处理法成本较高，生物强化法效果不稳定等问题限制了该技术的应用。
研究发现发酵液回流可明显提高反应基质的产气量，因为其中富集了丰富的甲烷菌、各类水解菌及水解酶。沼液回流技术普遍是将沼液直接回流进发酵罐中，目的是截流发酵罐内甲烷菌，但很少考虑到利用其中丰富的水解菌。本研究利用发酵液代替商业酶对污泥进行水解酸化预处理，从提高原料利用率的角度提高污泥产气效率。
本研究首先使用正交试验确定污泥厌氧发酵的最佳温度、总固体含量（TS）和接种量，随后利用不同比例的污泥厌氧发酵沼液对污泥进行酸化预处理，再通过产甲烷潜力试验（biochemical methane potential，BMP），以最终累计甲烷产率为量化指标，得出最佳沼液回流比。
1、材料与方法
1.1 试验原料
所用污泥取自四川省遂宁西南城市污水处理厂，放入4℃冰柜保存；接种物猪粪取自四川省成都市双流县，密闭常温保存。接种物在中温条件（37℃）下驯化3d，至产气甲烷体积分数>60%。原料各种物理基本理化特性见表1。
1.2 仪器设备
所用批次发酵设备如图1所示。整个装置由两个1L的带有导管的玻璃瓶全密封组成，一个是厌氧反应瓶，一个是集气瓶。水浴恒温加热控制反应温度。
备装有MolSieve13X（80/100SS）的3m不锈钢柱热导检测器。氦气用作载气，流速为5.2mL/min，进样口、色谱柱和检测器温度分别为200、80及220℃；气相色谱6890N（Agilent），配备火焰电离检测器和30m×0.25mm×0.25mm毛细管柱（DB-FFAP，USA），氢气用作载气，流速为5.2mL/min，进样口、色谱柱和检测器温度分别为200、80及220℃；SX-5-12型马弗炉；雷磁PHS-3E型pH仪；TU-1810SPC紫外可见光光度计；XMTD-7000电热恒温水浴锅。
1.3 试验方法
1.3.1 正交试验优化剩余污泥厌氧发酵条件
在文献调研的基础上，设温度（A）、总固体含量TS（B）、接种量（C）3个因子，每个因子设3个水平进行发酵试验，通过正交试验，以产气总体积为考察指标，确定剩余污泥厌氧发酵的最佳环境条件。正交因素水平表见表2.根据表2设计3因素3水平9组正交试验，每个组合4个平行，每天测量气体甲烷含量和产气体积。同体积接种物作为空白组。
1.3.2 不同比例回流液进行污泥酸化预处理
采用批次试验探索污泥发酵液回流对污泥酸化预处理的影响。收集污泥在最佳厌氧发酵条件下产气结束后的沼液为回流液，对污泥进行中温酸化预处理。回流液使用前需在35℃下驯化至产气甲烷体积分数>60%。按污泥鲜重，设置5个回流比（0%、5%、10%、15%和20%，V/m），添加回流液，后加入清水使各组酸化总体积相同。混合物密封放入35℃恒温培养箱中培养3d，每天定时取样测定挥发性脂肪酸（VFAs）含量，取样前需晃动瓶身至物料均匀混合。
1.3.3 产甲烷潜力试验
以上述5组回流液酸化预处理后的污泥为发酵底物，按最佳条件进行污泥BMP试验。每天测量气体成分和产气体积，最后根据累计产甲烷率采用Gompertze修正模型分析。对照组使用未进行酸化处理的污泥作为发酵底物进行BMP试验。同体积沼液接种物作为空白组。
1.4 测定方法
每日同时间点使用5mL注射器采集气体样，2h内使用气相色谱（安捷伦7890A）测量气体成分；液体样经1000r/min离心10min后，1mL上清液加入100μL甲酸酸化（10:1，V/V），混合液离心后过0.45μm水系滤膜，0.1μL进样量，气相色谱（安捷伦6890N）测定VFAs；产气总体积采用排水法测定；总氨氮（totalammonianitrogen，TAN）采用纳氏试剂比色法；总固体含量（TS）、挥发性固体含量（VS）采用烘干法测定。
1.5 计算方法
公式（1）中n为发酵天数，V为每日产气量（mL），c为气体甲烷含量（%），m为TS质量（g）。
公式（2）为Gompertze拟合方程，RCH4是实际甲烷产率（mL/gTS-1），使用平均值进行拟合，P为预测甲烷产率（mL/gTS-1），Rmax为最大日产甲烷量（mLg-1d-1），λ为反应延滞期（d）。P、Rmax、λ根据试验数据拟合得到。
公式（3）中TS1为初始含固率（%），TS2为反应结束后沼液含固率（%）。VS去除率算法一致。
试验数据用软件Excel2019和Origin9.0进行处理，除特殊说明外，所有结果以平均值±标准差表示，显著性差异标注于数据或图上。
2、结果与分析
2.1 污泥厌氧发酵环境条件正交试验
正交试验结果如表3所示。根据正交试验极差分析法可知，影响总产气量最主要因素是TS，其次是接种量、温度。由K值确定污泥厌氧发酵最佳环境条件为温度45℃，TS含量8%，接种量45%。根据各组产气结果，第3组气体体积最高，为6022±121mL。第3组环境条件为35℃，TS含量8%，接种量45%，与最佳环境条件差别仅为温度，且因为温度是3因素中影响最小的，所以从节约能源的角度出发，应将第3组条件设定为污泥厌氧发酵环境条件。
在其他研究过程中，发现污泥厌氧发酵条件为35℃，TS8%，接种量40%时（试验组），污泥累计产甲烷率为64.25mL/g，高于上述设定条件下（对照组）的产甲烷率57.09mL/g（P<0.05）。结果如图2所示。研究表明，不同接种物体积导致产酸菌和产甲烷菌比例不同，所以更高的接种量不一定产生更高的产甲烷量。所以，本研究污泥厌氧发酵条件优化结果为温度35℃，TS8%，接种量40%。下述如无特殊说明，污泥BMP试验均在此条件下进行。
2.2 不同回流比污泥酸化预处理
按照污泥鲜重添加5种不同比例的回流液（0%、5%、10%、15%和20%，V/m），分别是A组、B组、C组、D组和E组，每个处理3个平行，选用平均值作图（图3）。第0天为刚加入的回流液与样品混合后取样，即各组初始VFAs浓度分别为13669.2±839.7、14114.7±302.6、14390.6±78.1、15285.8±1460.8和14322.6±482.5mg/L，各组VFAs浓度初始值无显著差异（P>0.05）。从图3可以看出，酸化作用在第1天就开始了，并且B、C、D、E组VFAs含量在酸化第2天就达到了最高值，分别为18431±873.7、18152.8±65、21874.7±2007.6和25797.2±168mg/L，比初始值增加了30.58%、26.14%、43.10%和80.11%。且以乙酸、丙酸的含量增加为主。对照组A组在第3天达到最大值19783.5±1227mg/L，比初始值增加了44.73%。此外，除C组有不太明显的上升现象外（P>0.05），其他3组均在第3天出现了挥发酸浓度下降的现象，但均高于初始值。所以，最终VFAs浓度由大到小的顺序为A组（19783.5±1227mg/L）>E组（18857.6±550.1mg/L）>C组（18568.1±549.1mg/L）>D组（17761.9±514.3mg/L）>B组（16623.1±722.1mg/L）。
由以上结果可得，加入回流液处理后酸化阶段能更快达到产酸高峰，且回流比越大，VFAs浓度越高。这说明回流液能有效增加污泥酸化阶段效果，增加产酸量，缩短酸化时间。这可能是因为回流液富集了大量具有降解功能的微生物菌群和水解酶，这些微生物与水解酶共同作用，快速分解污泥中的大分子物质产生有机酸。此外，A组未添加回流液，但也表现出明显的酸化现象，说明原污泥内存在部分降解菌，在环境条件适宜时，便能分解污泥。Wu等通过微生物群落分析也发现，污泥来源对污泥厌氧发酵群落结构的影响巨大，说明了污泥所含的初始微生物的重要性。值得注意的是，除A组外，各组挥发酸浓度在第3天明显下降，可能是因为原料中的好氧微生物的生长代谢消耗了部分有机酸。这说明发酵回流液强化污泥酸化反应的效果跟反应时间存在密切关联，时间太短酸化不彻底，时间太长会折损回流液的酸化效果。污泥厌氧发酵是一个动态调控的过程，至今我们仍未掌握更加精准的调控规律，因此，回流液对整个厌氧发酵过程的影响，还有待进一步的BMP试验确定。
2.3 不同比例回流液对污泥厌氧发酵的影响
酸化后的污泥BMP试验结果如图4A所示，发酵周期为18d，各组累计产甲烷量（mL/g）由高到低为B组（82.36±0.56）>D组（76.80±2.82）>C组（72.54±2.08）>E组（71.51±2.57）>A组（68.54±2.35）。该结果说明，回流比为5%时，回流液对污泥厌氧消化过程的促进作用最明显。而B组在酸化阶段结束时VFAs含量最低，说明VFAs含量并不能准确地推断系统产气能力，还需根据BMP试验来确定最佳工艺和回流比。
CK为原污泥直接发酵，累计产甲烷量为57.21±1.92mL/g。B组相对CK组，累计产甲烷量提高了43.96%，D组提高了34.24%，C组提高了26.8%，E组提高了25%，A组提高了19.8%。该结果说明，回流液预处理能提高污泥的甲烷产率；不同回流比对污泥的两相厌氧消化反应的促进程度不同，随着回流比的增大，呈现先增加后降低的趋势。
本研究对试验数据进行了Gompertz修正方程拟合（图4B），进一步分析污泥厌氧消化产沼气动力学过程。根据表4的参数结果显示，B组的理论甲烷产率最高，为85.53mL/g，比CK组提高了49.5%。此外，添加了回流液的组理论甲烷产率均比A组和CK组高，与实际趋势相同。B组最大产甲烷速率（Rmax）为8.81mLg-1d-1，比CK组提高了46.83%，相对A组则提高了20.52%，其他3个回流比也都高于CK组和A组。此结果表明，回流液能提高污泥的产甲烷率，提高原料有机质转化率。另外，污泥经过酸化处理后发酵，延滞期明显低于CK组（P<0.05），但不同回流比之间的延滞期差距不明显（P>0.05），这可能和酸化时间有关。本研究的酸化停留时间为3d，此时各组VFAs含量从最高值下降，说明各组都达到了酸化成熟阶段，所以各回流比处理对缩短厌氧发酵延滞期的作用差距不明显。此外，第3天各组VFAs含量差别不大，则高回流比造成的pH值差异不大，对产甲烷过程的抑制作用也不明显。值得注意的是，A组未添加回流液，但延滞期仍低于CK组（P<0.05），说明中温培育也能缩短反应总时间，提高污泥厌氧消化系统的效率。污泥酸化预处理厌氧发酵工艺比普通发酵更具有应用价值。污泥酸化预处理，高活性微生物水解菌成功的对污泥结构进行了破坏，同时将更多的污泥有机物在短时间内转化为可被甲烷菌利用的有机酸，从而提高了污泥厌氧发酵产气率。
根据表4的结果，B组Rmax值高于A组，说明B组系统内的甲烷活性高于A组，因为回流液能增加系统内甲烷菌的丰度，使B组有机质转化效率提高，从而产生了更多甲烷。而回流比更高的C、D、E组Rmax值略低于B组，可能是因为后3组的有机质在预处理阶段被消耗太多，导致产甲烷期能被甲烷菌利用的有机质减少，底物浓度限制菌落活性，因此污泥产甲烷率更低。
图5A记录了在发酵过程中各组TAN和pH的平均值变化，B、C、D和E组的初始TAN值高于CK组和A组，但随着发酵反应的进行各组之间TAN值差异减小，说明加入回流液会增加产甲烷反应初始TAN值，但并不会出现系统氨抑制，使反应失衡。该结果与Chan等的研究结果一致。此外，各组pH值在反应过程中也较稳定，处理组与对照组之间差异不大。
图5B给出了各组TS去除率（%）结果，由大到小排序为A组（29.36±0.14）>B组（24.06±0.39）>D组（21.47±0.05）>E组（17.00±0.18）>C组（14.83±0.33）；VS去除率（%）变化趋势一致：A组（31.22±0.18）>B组（29.68±0.29）>D组（23.56±0.28）>E组（16.99±0.23）>C组（15.46±0.08）。该结果说明，添加5%回流液就能明显促进污泥有机质的去除。根据挥发酸试验结果，回流比越大，最高VFAs值越大。D、E组在酸化阶段VFAs值偏高而发酵产气阶段VS去除率偏低，进一步证明了过高的回流比，会使污泥有机质在酸化阶段被浪费，无法进行有效的能源转换。值得注意的是，A组的TS、VS去除率高于添加了回流液的组，但实际产甲烷率却没有增加，该结果说明，A组的污泥有机质并没有转化为生物气体甲烷。可能是因为A组的甲烷菌活性不高，菌落活性低限制了底物转化率，说明回流液有优化厌氧产气反应群落结构的效果。因此根据试验结果可知，回流液能够明显强化污泥厌氧发酵效果，且最佳回流比为5%（V/m，TS）。
3、讨论
本研究结果表明，加入5%回流液，在35℃下酸化预处理3d，污泥厌氧发酵累计产甲烷率为68.54±2.35mL/g，提高了43.96%。回流液酸化预处理，能够提高污泥总VFAs含量，提高甲烷菌含量，优化反应器产酸菌与产甲烷菌的比例，从而提高污泥产甲烷率。回流液所含丰富的水解酶和水解菌，使它具有代替商业酶的应用潜能，可作为污泥酶预处理的廉价原料来源。此外，从工艺实施角度，本研究的回流液酸化预处理与物理、化学预处理方式相比，设备成本优势明显。之前的研究结果表明，热水解技术使污泥厌氧发酵投资费增加了26%，一吨干污泥处理费用高达550元。高昂的设备费和能耗费，同样使热水解、超声等技术难以推广实施。而污泥回流液酸化预处理工艺，无须增加设备费，且易于操作，能耗低，并能有效提高污泥产气效率，非常适用于我国中小型污泥厌氧发酵厂的升级改造工程。
在同样的温度和预处理时间下，与未添加回流液组相比，回流液组更低的TS、VS去除率能获得更高的甲烷产量，说明回流液能促进污泥有机质定向转化为能源物质甲烷，加强污泥的“资源化”利用。
除了提高污泥产甲烷率，回流工艺能提高反应稳定性。厌氧发酵工程会使部分沼液直接回流进入发酵罐，容易产生氨抑制、酸积累等致使反应器失衡、产气被抑制甚至停止产气。本研究使用低回流比强化厌氧反应，另一方面，发酵液回流入酸化阶段，通过原料产酸来平衡回流液的氨抑制作用，更能加强厌氧系统长期运行的稳定性。
值得注意的是，当加入20%回流液时，污泥总VFAs含量提高了80.11%，但并没有获得更高的污泥累计甲烷产量。因为回流液中含有部分好氧微生物消耗了这些物质，造成了污泥有机质的浪费。如果能够屏蔽回流液中杂菌的影响，也许能进一步提高污泥产甲烷率。例如，Kavitha等使用生物法强化污泥酸化阶段，他们在污泥酸化相中添加了两株分离自污泥的产蛋白酶、淀粉酶的Bacillus03/04菌株培养液，进行72h酸化后，使污泥产甲烷率提高了80%，远高于本研究结果。此外，回流液的来源也会影响污泥的产气效果。Luo等通过对餐厨垃圾产酸相的渗滤液进行50%回流，使餐厨垃圾产甲烷率提高了70%左右。这可能是因为产酸相的条件更适合富集水解菌和水解酶，所以当它作为接种物时对原料的水解效果更强。污泥两相厌氧发酵中的产酸相的渗滤液可能存在更丰富的、更有利于降解污泥类有机质的水解菌，如果回流污泥产酸相渗滤液，或在体系中添加从产酸相沼液中分离出的高效水解菌，或可以进一步强化污泥的预处理效果。
4、结论
本研究评价了中温条件下（35℃），污泥发酵沼液对污泥厌氧发酵产沼气的影响，证明了发酵液回流酸化预处理污泥工艺的可行性。试验结果表明，当回流比为5%时（V/m，TS），污泥厌氧发酵周期为3+17d，累计产甲烷率为82.36±0.56mL/g。根据Gompertz修正方程拟合结果，得到试验延滞期缩短至2.97d，最大日产甲烷量为8.81mLg-1d-1。该研究成果优化了传统污泥厌氧发酵工艺，提高了污泥产气率，且易操作，能耗低，为回流液的工程应用提供理论基础。此外，回流液对污泥预处理的能力有限，今后可以从浓缩回流液浓度，定向富集回流液水解功能菌群等角度出发增强回流液对污泥的酸化预处理能力，进一步提高污泥累计产甲烷率。（来源：中国科学院成都生物研究所，中国科学院大学，中国科学院环境与应用微生物重点实验室，广西师范大学，四川能投水务投资有限公司）