申请日2010.10.26
公开(公告)日2011.03.30
IPC分类号C02F9/04; C12P19/40; C12P21/02
摘要
本发明涉及一种薯蓣皂素生产废液处理利用方法，属生物化工技术领域。薯蓣皂素生产废水处理方法，根据目前薯蓣皂素的生产工艺，用含氮碱性化合物将水解液中的废酸中和，对中和后的废液进行絮凝沉降、膜过滤、树脂吸附等一系列预处理，将废液中影响发酵的成分除掉，得到的主要含葡萄糖及铵盐的处理液，进行再利用。本发明有效解决了薯蓣皂素生产中的废液排放问题，为其找到了一个高附加值的利用方法，实现了两个大产业的整合，符合可持续发展的要求，具有很好的工业化前景。
翻译权利要求书
1.薯蓣皂素生产废水处理方法，其特征是：根据目前薯蓣皂素的生产工艺，用含氮碱性化合物将水解液中的废酸中和，对中和后的废液进行絮凝沉降、膜过滤、树脂吸附等一系列预处理，将废液中影响发酵的成分除掉，得到的主要含葡萄糖及铵盐的处理液，进行再利用。
2.根据权利要求1所述的薯蓣皂素生产废水处理方法，其特征是：水解液是利用传统的酸水解或者是改良后的酸水解方法后的水解液，预处理是将水解废液中和用含氮碱性化合物采用氨气，氨水、碳酸铵和碳酸氢铵等中的一种或几种，但不限于这四种，目的是中和废酸得到铵盐，为发酵提供氮源;
中和、絮凝沉降后除去其中的大分子物质，所得处理液再用截留分子量为200-2000的膜过滤;所用膜包括纤维素脂类、聚砜类、聚烯烃类、氟材料、聚氯乙烯等有机膜高分子材料及各种无机材料膜;
经膜过滤后的处理液，用大孔吸附树脂进行吸附，除掉其中的小分子杂质，收集糖液。
3.根据权利要求1或2所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：再利用分为调配培养基、发酵生产、分离纯化三步，其中：
调配培养基：处理液中铵盐作为酵母发酵的氮源，葡萄糖作为培养酵母的碳源，同时补充酵母生长所需要的其他必备元素;
发酵生产：用于酵母发酵，酵母内会产生积累SAM和GSH，通过加入所需前体物质，增加累积量;
分离纯化：收集菌株经过分离，收集产物SAM或GSH或二者同时收集;再经过提纯，得到高纯度的产品SAM和/或GSH。
4.根据权利要求3所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：再利用中调配培养基：稀释收集到的葡萄糖液，使其浓度达到4~6%，优选5%;调节糖液中葡萄糖和铵盐的比例满足C:N=4:1~6:1，优选6:1;PH值为4.0-7.5 的范围，优选6.0;糖液中加入有机氮源，磷源，微量元素;所用有机氮源为蛋白胨，酵母粉，酵母提取物中的一种或几种，但不限于这三种，控制含量在0.5-15g/L，优选5g/L;所用磷源为磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾中的一种或几种，但不限于这三种，控制含量在0-15g/L，优选6g/L;所用包括硫酸镁在内的微量元素含量控制在0-2.0g/L，优选1.5g/L。
5.根据权利要求3所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：再利用中发酵生产：酵母培养阶段，培养时间为20-48小时，优选30小时;培养温度为26-36℃优选28℃;
培养过程中，若想提高GSH产量可加入合成前体谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸;加入量为0-10mmol/L，若以消耗废液中葡萄糖为目的，可不加合成前体;生产SAM则需要加入所需的前体物质L-蛋氨酸，加入量为2~5g/L;
酵母培养结束后，培养液在5000r/min以上的条件下离心30分钟，收集菌体。
6.根据权利要求3所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：再利用中分离纯化：收集产物GSH，其中分离GSH采用热水抽提或乙醇抽提，优选热水抽提;调节PH至1.0-5.0之间，优选3.0，热水抽提：温度80-100℃，优选95℃，抽提时间8-12分钟，优选10分钟，抽提时要不停的搅拌，抽提后迅速冷却;乙醇抽提：所用乙醇浓度40%-60%，优选40%，抽提时间1.5-2.5小时，优选2小时，抽提时要不停的搅拌;酵母跟抽提液质量比例为1:4-1:10，优选1:5;抽提结束后，于5000r/min以上的条件下离心30分钟，取上清;
纯化GSH：抽提液用截留分子量500-2000的膜处理，除掉抽提液中的蛋白质等大分子物质，再选用阳离子交换树脂进行树脂交换，选取包括D001cc、D061和732在内的强酸型阳离子交换树脂吸附纯化GSH，优选D001cc;以2-8倍树脂体积/每小时的上样速度，其中优选2倍树脂体积/每小时，上样PH值为2.0-6.0，优选3.0，用0.5-8倍树脂体积/每小时的洗脱液进行洗脱，洗脱液主要用氢氧化钠溶液，盐酸，氨水，氯化钠溶液， 优选0.2mol/L盐酸，以1倍树脂体积/每小时的速度洗脱。
7.根据权利要求3所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：再利用中分离纯化：收集产物SAM，其中分离SAM采用乙酸乙酯法或高氯酸法，优选乙酸乙酯法;乙酸乙酯法：调节PH到1.0-5.0之间，优选3.0，先加入乙酸乙酯-水的混合液，后加入硫酸进行抽提;所用乙酸乙酯与水的比例为1：1，乙酸乙酯-水混合液与湿酵母配比为0.25-0.40L/kg，优选0.30L/kg，混合后快速搅拌30min;所用硫酸浓度为0.3-0.4mol/L，优选0.35 mol/L，加入硫酸量为乙酸乙酯-水混合液的2倍，搅拌1.5-2小时，优选1.5小时;抽提结束后，于5000r/min以上的条件下离心30分钟，取上清;高氯酸法：菌体用1-3 mol/L高氯酸搅拌抽提1-3小时，优选1.5 mol/L 抽提1.5小时，5000r/min以上离心30分钟，取上清;
纯化SAM：抽提液用截留分子量500-2000的膜处理，除掉抽提液中的蛋白质等大分子物质，抽提液再选用阳离子交换树脂进行树脂交换，选取包括D113、JK110、D151和D152在内的弱酸型阳离子交换树脂，其中优选D152;以2-8倍树脂体积/每小时的上样速度，其中优选2.5倍树脂体积/每小时，上样PH值为2.0-6.0，优选5.0，用2-8倍树脂体积/每小时的洗脱液进行洗脱，洗脱液主要是乙酸，盐酸，硫酸等，优选0.3mol/L硫酸，以2倍树脂体积/每小时的速度洗脱，得到SAM的硫酸盐，洗脱SAM前可用0.1mol/L乙酸预洗脱，洗掉杂质。
8.根据权利要求3所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：再利用中分离纯化：同时生产GSH和SAM：先分离SAM，然后分离GSH，其中SAM按单独生产SAM的方法分离提取，GSH采用乙醇抽提法分离收集， SAM和GSH洗脱后，对洗脱液进行反渗透然后冷冻干燥，得到纯品SAM和GSH。
9.根据权利要求3所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：再利用中发酵生产所用菌株，可以采用的有高产谷胱甘肽的酵母菌及变异株、高产腺苷蛋氨酸的酵母及变异株，如利用假丝酵母属酵母及变异株，酵母菌属酵母及变异株，面包酵母属及变异菌株，Log酵母及变异菌株，毕赤酵母及变异株，大肠杆菌及变异株，霉菌及变异株等，但不限于以上菌株;
再利用中发酵生产所用菌株，产朊假丝酵母变异株，休哈塔假丝酵母变异株，酿酒酵母菌株变异菌株，面包酵母变异菌株，Log酵母变异菌株，嗜单宁管囊酵母变异株，毕赤酵母诱变株，大肠杆菌变异菌株或者工程菌等，其中优选酿酒酵母变异菌株和产朊假丝酵母变异株和重组的毕赤酵母诱变株;
所述酵母变异株采用具有Zn2+抗性的酿酒酵母及高产GSH变异株;假丝酵母变异株采用具有乙硫氨酸/甲硫氨酸抗性的产朊假丝酵母及高产GSH变异株，基因工程菌可以是酿酒酵母的基因工程菌，也可以是毕赤酵母的基因工程菌。
10.根据权利要求3所述的薯蓣皂素生产废水处理方法联产GSH和SAM的新工艺，其特征是：薯蓣皂素生产采用公知的酸水解方法，经有机溶剂提取或超临界萃取，得到皂素;薯蓣皂素生产中水解所用酸为3%-6%硫酸或6%~12%盐酸，但不限于以上两种，水解条件为温度100-160℃，压力1-2Mpa，时间1-8小时;薯蓣皂素有机溶剂提纯所用提取剂为石油醚，丙酮， 120#溶剂汽油等有机溶剂中的一种或几种，但不限于以上三种;提取时间为8-20小时，提取时加入包括活性炭在内的物质脱色。
说明书
薯蓣皂素生产废水处理方法及联产GSH和SAM的新工艺
技术领域
本发明涉及一种薯蓣皂素生产废液处理利用方法，属生物化工技术领域。
背景技术
薯蓣皂苷元俗称薯蓣皂素，是合成甾体激素药物的基础原料和起始中间体，以薯蓣皂素为基础几乎可以合成所有的甾体激素药物，故有“激素之母”之称。另外，薯蓣皂素还有调节人体机能、防病抗衰老、减肥、补钙、调节脑神经、抗肿瘤、抗血小板凝聚、抑菌、杀虫等功效;目前尚不能化学合成，只能从动植物体内提取。黄姜，学名盾叶薯蓣，根茎中富含薯蓣皂苷，薯蓣皂素大部分都由黄姜中提取。黄姜中除了含有薯蓣皂苷外，还含有40-50%淀粉和40-50%的纤维素及其它微量化学成分。
目前，从黄姜中提取薯蓣皂素最常用的方法就是酸水解法，或者发酵法、酶解法等改良的酸水解法，无论哪种方法，生产过程中都会产生大量废水;产生废水的环节主要来自预处理阶段的酸水解、过滤、中和、洗涤所产生的综合废水。黄姜中淀粉水解后形成的葡萄糖、变性蛋白、多肽、部分纤维素、氨基酸等物质和大量的酸被排入废水中，致使废水中COD和BOD值严重超标。这种废水处理难度大，直接排放会污染环境，这个问题严重制约了该产业的发展。尽管现在有人提出了许多方法来解决废液问题，例如有人提出将废液中和后用来发酵生产乙醇，这个方法虽能将废液中的葡萄糖充分利用，但废酸完全损耗，并且乙醇价廉，该法经济价值不高。所以现在黄姜生产薯蓣皂素工业中废水的处理和葡萄糖溶液的再利用问题仍是困绕该产业健康发展的核心所在。
谷胱甘肽(GSH)，又名γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸 ，是细胞内存在最丰富的小分子硫醇类化合物，是细胞内主要还原物质，能保护细胞免受氧化型、毒害性化合物和辐射的伤害。具有解毒、辐射病及辐射防护、保护肝脏、抗过敏、改善某些疾病的病程和症状、养颜美容护肤、增加视力及眼科疾病、抗衰老作用。同时GSH还是细胞内某些酶的辅因子，参与细胞内的代谢循环。因此，GSH在医学、食品及化妆品方面有着广泛用途。
目前生产GSH的方法主要有化学合成法、酶法和发酵法。化学合成法，过程很复杂，条件苛刻，分离十分困难，产品纯度低，存在环境污染。酶法，生产过程简化，但GSH合成酶系的活性普遍较低。相对来讲，发酵法是生产谷胱甘肽最合适的方法。
谷胱甘肽分离纯化：从细胞中提取谷胱甘肽主要用热水抽提和有机溶剂抽提。分离纯化主要有铜盐法、离子交换树脂法、电渗析法、双水相法四种。铜盐法具有工业使用价值，但步骤复杂，污染环境。离子交换法经济效益较高，已有多篇专利和文献报道，研究显示大孔型及交联度较小的阳离子交换树脂的分离效果较好。电渗析法电渗析是在pH值3～6进行，克服了谷胱甘肽的不稳定性。双水相法谷胱甘肽的总萃取率可达80%以上。但双水相组成系统一般比较昂贵，目前还处于实验室研究阶段，尚不具有工业化能力。
S-腺苷-L-蛋氨酸又称S-腺苷甲硫氨酸，简称SAM，是生物体内广泛存在的生物小分子。作为基团提供者和酶的诱导剂参与许多关键的生化反应;作为甲基供体，SAM参与合成大量代谢物。SAM可以控制衰老和一些疾病如癌症的恶化，对荷尔蒙、神经递质、DNA、RNA和蛋白质的合成和代谢以及保持质膜的流动性等具有重要作用，是合成细胞内另一重要小分子化合物谷胱甘肽的前体。具有治疗肝病，抑郁症和关节炎的强大疗效。
目前生产SAM的方法主要也是化学合成法、酶法和发酵法。化学合成法生产SAM由于产物中异构体多、分离提纯困难及SAM分子的不稳定特性，工业化前景不大。酶法合成中由于生物细胞中SAM合成酶浓度较低、分离提取困难及ATP的原位供给代价高昂，成为大规模生产的限制因素。酶法合成目前还只适合于制备供科学研究使用的放射性标记的SAM分子。目前，发酵法是工业规模生产SAM的主要方法。其中，酵母具有较高的过量积累SAM的能力，是最常用的微生物。
SAM分离纯化：有机溶剂萃取与化学试剂破胞相结合的方法是一种工业生产普遍采用的有效方法。利用离心或过滤的方法可以将萃取液和细胞碎片很好地分离。萃取液中存在着大分子蛋白、多糖及核酸等杂质，分离方法主要有苦酮酸等沉淀法、超滤或凝胶柱分离、酸性阳离子交换树脂进行离子交换和吸附，由于SAM分子有较强的极性，强酸和弱酸型阳离子交换树脂都可以使用。
发明内容
本发明的目的是解决目前薯蓣皂素生产工业中的废水污染问题，提供一种薯蓣皂素生产废水处理方法，方法简单，使废液中的葡萄糖及废酸可以得到高效利用，且降低目的产物的生产成本;本发明更重要的目的是实现产业的联产，低成本，多产业化，产品收率高，纯度高。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：薯蓣皂素生产废水处理方法，根据目前薯蓣皂素的生产工艺，用含氮碱性化合物将水解液中的废酸中和，对中和后的废液进行絮凝沉降、膜过滤、树脂吸附等一系列预处理，将废液中影响发酵的成分除掉，得到的主要含葡萄糖及铵盐的处理液再利用，进行发酵联产GSH和SAM。
所述联产GSH和SAM的新工艺，再利用分为调配培养基、发酵生产、分离纯化三步，其中：
调配培养基：处理液中铵盐作为酵母发酵的氮源，葡萄糖作为培养酵母的碳源，同时补充酵母生长所需要的其他必备元素;
发酵生产：用于酵母发酵，酵母体内会积累SAM和GSH，通过加入所需的前体物质，增加累积量;
分离纯化：收集菌株经过分离，收集产物SAM或GSH或二者同时收集;再经过提纯，得到高纯度的产品SAM和/或GSH。
所述预处理：水解废液中和用含氮化合物采用氨气，氨水、碳酸铵和碳酸氢铵等中的一种或几种，但不限于这三种，目的是中和废酸生产铵盐，为发酵提供氮源。
所述预处理：中和、絮凝沉降后除去其中的大分子物质，处理液再用截留分子量为200-2000的膜过滤。所用膜包括纤维素脂类、聚砜类、聚烯烃类、氟材料、聚氯乙烯等有机膜高分子材料及各种无机材料膜。
所述预处理：经膜过滤后的处理液，用大孔吸附树脂进行吸附，除掉其中的小分子杂质，收集糖液。
所述再利用中调配培养基：稀释收集到的葡萄糖液，使其浓度达到4-6%，优选5%;调节糖液中葡萄糖和铵盐的比例满足C:N=4:1-6:1，优选6:1;PH值为4.0-7.5 的范围，优选6.0;糖液中加入有机氮源，磷源，微量元素。所用有机氮源为蛋白胨，酵母粉，酵母提取物中的一种或几种，但不限于这三种，控制含量在0.5-15g/L，优选5g/L;所用磷源为磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾中的一种或几种，但不限于这三种，控制含量在0-15g/L，优选6g/L。所用包括硫酸镁在内的微量元素含量控制在0-2.0g/L，优选1.5g/L。
所述再利用中发酵生产：酵母培养阶段，培养时间为20-48小时，优选30小时;培养温度为26-36℃优选28℃。培养过程中，若想提高GSH的产量，可加入合成前体谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸;加入量为0-10mmol/L，若以消耗废液中葡萄糖为目的，可不加合成前体;生产SAM则需要加入所需的前体物质L-蛋氨酸，加入量为2-5g/L。酵母培养结束后，培养液在5000r/min以上的条件下离心30分钟，收集菌体。
所述再利用中分离纯化：收集产物GSH，其中分离GSH采用热水抽提或乙醇抽提，优选热水抽提;调节PH至1.0-5.0之间，优选3.0，热水抽提：温度80-100℃，优选95℃，抽提时间8-12分钟，优选10分钟，抽提时要不停的搅拌，抽提后迅速冷却;乙醇抽提：所用乙醇浓度40%-60%，优选40%，抽提时间1.5-2.5小时，优选2小时，抽提时要不停的搅拌;酵母跟抽提液质量比例为1:4-1:10，优选1:5;抽提结束后，于5000r/min以上的条件下离心30分钟，取上清;
纯化GSH：抽提液用截留分子量500-2000的膜处理，除掉抽提液中的蛋白质等大分子物质，抽提液再选用阳离子交换树脂进行树脂交换，选取包括D001cc、D061和732在内的强酸型阳离子交换树脂吸附纯化GSH，优选D001cc;以2-8倍树脂体积/每小时的上样速度，其中优选2倍树脂体积/每小时，上样PH值为2.0-6.0，优选3.0，用0.5-8倍树脂体积/每小时的洗脱液进行洗脱，洗脱液主要用氢氧化钠溶液，盐酸，氨水，氯化钠溶液， 优选0.2mol/L盐酸，以1倍树脂体积/每小时的速度洗脱。
所述再利用中分离纯化：收集产物SAM，其中分离SAM采用乙酸乙酯法或高氯酸法，优选乙酸乙酯法;乙酸乙酯法：调节PH到1.0-5.0之间，优选3.0，先加入乙酸乙酯-水的混合液，后加入硫酸进行抽提;所用乙酸乙酯与水的比例为1：1，乙酸乙酯-水混合液与湿酵母配比为0.25-0.40L/kg，优选0.30L/kg，混合后快速搅拌30min;所用硫酸浓度为0.3-0.4mol/L，优选0.35 mol/L，加入硫酸量为乙酸乙酯-水混合液的2倍，搅拌1.5-2小时，优选1.5小时;抽提结束后，于5000r/min以上的条件下离心30分钟，取上清;高氯酸法：菌体用1-3 mol/L高氯酸搅拌抽提1-3小时，优选1.5 mol/L 抽提1.5小时，5000r/min以上离心30分钟，取上清;
纯化SAM：抽提液用截留分子量500-2000的膜处理，除掉抽提液中的蛋白质等大分子物质，抽提液再选用阳离子交换树脂进行树脂交换，选取包括D113、JK110、D151和D152在内的弱酸型阳离子交换树脂，其中优选D152;以2-8倍树脂体积/每小时的上样速度，其中优选2.5倍树脂体积/每小时，上样PH值为2.0-6.0，优选5.0，用2-8倍树脂体积/每小时的洗脱液进行洗脱，洗脱液主要是乙酸，盐酸，硫酸等，优选0.3mol/L硫酸，以2倍树脂体积/每小时的速度洗脱，得到SAM的硫酸盐，洗脱SAM前可用0.1mol/L乙酸预洗脱，洗掉杂质。
所述再利用中分离纯化：同时生产GSH和SAM：先分离SAM，然后分离GSH，其中SAM按单独生产SAM的方法分离提取，GSH采用乙醇抽提法分离收集， SAM和GSH洗脱后，对洗脱液进行反渗透然后冷冻干燥，得到纯品SAM和GSH。
所述再利用中发酵生产所用菌株，可以采用高产谷胱甘肽的酵母菌及变异株、高产腺苷蛋氨酸的酵母及变异株，如利用假丝酵母属(Candida)酵母及变异株，酵母菌属(Saccharomyces)酵母及变异株，面包酵母属(Backer′s yeast)及变异菌株，Log酵母(Saccharomycodes ludwigii)及变异菌株，毕赤酵母(Pichia fermentans)及变异株，大肠杆菌(Eschercichia coli.)及变异株等，霉菌(mold)及变异株等，但不限于以上菌株。
所述再利用中发酵生产所用菌株，产朊假丝酵母(Candida utilis)变异株，休哈塔假丝酵母(Canadida shehatae)变异株，酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)变异菌株，面包酵母(Backer′s yeast)变异菌株，Log酵母(Saccharomycodes ludwigii)变异菌株，嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)变异株，毕赤酵母(Pichia fermentans)诱变株，大肠杆菌(Eschercichia coli.)变异菌株或工程菌等，其中优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)变异菌株和产朊假丝酵母(Candida utilis)变异株和重组的毕赤酵母(Pichia fermentans)诱变株。
所述酵母变异株采用具有Zn2+抗性的酿酒酵母及高产GSH变异株;假丝酵母变异株采用具有乙硫氨酸/甲硫氨酸抗性的产朊假丝酵母及高产GSH变异株，基因工程菌可以是酿酒酵母的基因工程菌，也可以是毕赤酵母的基因工程菌。
所述废水处理与薯蓣皂素生产联产工艺：薯蓣皂素生产采用公知的酸水解方法，经有机溶剂提取或超临界萃取，得到皂素;薯蓣皂素生产中水解所用酸为3%-6%硫酸或6%-12%盐酸，但不限于以上两种，水解条件为温度100-160℃，压力1-2Mpa，时间1-8小时;薯蓣皂素有机溶剂提纯所用提取剂为石油醚，丙酮， 120#溶剂汽油等有机溶剂中的一种或几种，但不限于以上三种;提取时间为8-20小时，提取时加入包括活性炭在内的物质脱色。
本发明的积极效果
该工艺路线既可以解决薯蓣皂素生产中的废液处理问题，使废液中的葡萄糖和酸得到高附加值的利用，几乎不对环境造成污染，同时实现了产业整合。在国际市场对薯蓣皂素、SAM、GSH需求量不断提高，国内薯蓣皂素产量不断增加，同时SAM和GSH进口量不断增长的情况下，该工艺可以在减耗减排的同时增加产出，这无疑给相关产业注入了新的活力，带动了一系列相关产业的发展。同时它符合可持续发展的要求，为绿色产业的发展提供了一个新思路。