申请日2013.09.09
公开(公告)日2013.12.25
IPC分类号C02F3/34; C02F101/34; C12R1/69; C12N1/14
摘要
本发明公开了一种米曲霉降解废水中蒽醌类化合物工艺技术，涉及生物工程领域。即利用米曲霉作为出发菌株，通过液体摇瓶培养、液体菌种扩大培养、菌液转接到含有蒽醌类化合物废水并补充一定的营养物质，进行发酵培养。采用此工艺蒽醌类化合物去除率可以达到60～100%，同时可以获得用作饲料添加剂的菌体和活性分子。
权利要求书
1.一种米曲霉降解蒽醌类化合物废水工艺技术，其特征在于按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、菌体液体扩大培养，液体发酵去除废水中蒽醌类化合物，蒽醌类化合物去除率可以达到60～100%，
同时可以获得用作饲料添加剂的菌体和活性分子。
2.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物废水工艺技术，其特征在所用的菌种是米曲霉的任意一株菌种。
3.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物工艺技术，其特征在所适用的废水是任意一种含蒽醌类化合物的废水，如发酵法生产蒽醌类化合物的废液、从植物中提取蒽醌类化合物的废液或者以蒽醌类化合物为原料合成其他产品的废液。
4.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物工艺技术，其特征在其中所述的试管扩大培养中的扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基。
5.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物工艺技术，其特征在其中所述的液体摇瓶培养中和菌体液体扩大培养中的液体摇瓶培养基和液体菌体培养基均为：葡萄糖5～30克/升，蛋白胨0～5克/升，酵母膏0～5克/升，硫酸镁0.2～1克/升，吐温-80 0.5～10克/升，磷酸二氢钾2～9克/升，pH5～8，120～140℃灭菌20～40分钟。
6.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物工艺技术，其特征在其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种3-5块米曲霉试管斜面菌体(5×5mm)于装有40～120 mL培养基的250mL三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时。
7.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物工艺技术，其特征在其中所述的菌体培养工艺为，按1～20%(体积比)的接种量将摇瓶培养种子液接种到液体菌体扩大培养中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18～72小时。
8.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物废水工艺技术，其特征在所述的含有蒽醌类化合物废水培养基为：含有蒽醌类化合物的废水经过浓缩或稀释使蒽醌类化合物浓度达到1～50克/升废水1000L，葡萄糖5～30千克，黄豆饼粉0.5～2千克;硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按此比例放大。
9.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解蒽醌类化合物废水工艺技术，其特征在其中所述的降解废水工艺为：按2～20%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养36～168小时，即可降解蒽醌类化合物。
10.根据权利要求书1获得的降解废水经过3000～6000rpm离心5～20分钟，得到米曲霉菌丝体，菌丝体烘干，保存，
滤液经过分子量5000～10000膜截留浓缩50～100倍，-20℃冷冻干燥，每升废液可以得到2-5克菌丝体和活性分子。
说明书
一种米曲霉降解废水中蒽醌类化合物工艺技术
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特指利用米曲霉降解含有蒽醌类化合物的废水。将原废水浓缩或稀释至蒽醌类化合物含量在1～50克/升后，补充培养基成分，接入米曲霉菌种降解废水中的蒽醌类化合物。米曲霉降解后，蒽醌类化合物的去除率可达到60～100%，BOD去除率达到90～99%，同时降解后的废水可以提取出菌丝体和活性成分用作饲料添加剂。
背景技术
蒽醌化合物种类繁多,是重要的化工原料和中间体,颜色鲜艳,范围广,因而在纺织、印染等行业中广泛应用,不仅可用于涤纶及混纺织物的印染,还可用于锦纶、腈纶、丙纶、醋纤、羊毛、丝绸的印染。同时随着环保要求的日益提升, 偶氮染料禁用范围扩大, 也使得蒽醌染料的重要性更为突出, 使其在印染工业中的应用越来越广泛。但是蒽醌类化合物不仅生产废水水量大,而且该化合物色度高,溶解度低!熔点高!性质稳定!难以生物降解,又具有较高的亲脂性,直接排放的污水中蒽醌通过沉降!食物链富集等作用可长期滞留于水体!土壤!沉积物和空气中。因此探索有效降解蒽醌类化合物的技术，对于社会的和谐与发展具有十分重要的意义。
目前关于含有蒽醌类化合物废水的处理专利有几项，但是主要方法是蒽醌的回收利用、微生物降解以及氧化去除。如专利“1,4-二羟基蒽醌生产废水的治理和资源回收方法”(申请号00112386.6)公开了利用大孔树脂吸附，再用氢氧化钠解析回收利用1,4-二羟基蒽醌生产废水中的蒽醌类化合物的方法;专利“一种1，4-二羟基蒽醌工艺废水的回收方法” (申请号 200410013484.X)公开了利用浓缩、冷却、结晶、分离和干燥等技术回收利用蒽醌的方法。专利“鞘氨醇单胞菌属菌株及其在蒽醌染料废水脱色中的应用”(申请号 200410020832.6)公开了鞘氨醇单胞菌菌株，在蒽醌染料废水脱色中应用，该菌脱色能力强，降解速度快，但是只能适合于低浓度蒽醌废水;还有采用电化学氧化(专利号200910029887.6)和光催化氧化(200710011629.6)，这两种方法还需要进一步处理。与这些方法相关论文也有不少报道。另外一些博士和硕士学位论文报道了黄孢原毛平革菌吸附降解蒽醌类化合物机制进行了研究，但是未涉及其工艺技术。
本发明人经过深入的研究，摸索出一种以米曲霉(Aspergillus oryzae)作为出发菌株，降解含有蒽醌类化合物废水的方法。该方法不同于过去的方法在于所使用的菌种是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、 我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种，降解废水中蒽醌类化合物，同时得到菌体蛋白和含有一种或几种酶制剂(糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶)等发酵液的活性成分。这些菌体和活性成分可以作为饲料添加剂。
发明内容
本发明提供的是米曲霉降解废水中蒽醌类化合物的生物技术。废水经过米曲霉降解后，其蒽醌类化合物去除率可到达60~100%。
本发明一种米曲霉降解蒽醌类化合物工艺技术，按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、菌体液体扩大培养，离心收集菌体，然后通过发酵降解废水中蒽醌类化合物。降解后的废水经过离心获得的米曲霉菌丝体，滤液经过分子截留获得多种生物活性分子，这些菌丝体和生物活性分子可以用在饲料添加剂中。
本发明所用的菌种是米曲霉任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。
本发明所适用的废水是任意一种含蒽醌类化合物的废水，如发酵法生产蒽醌类化合物的废液、从植物中提取蒽醌类化合物的废液或者以蒽醌类化合物为原料合成其他产品的废液。
其中所述的试管扩大培养中的试管扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页。
其中所述的液体摇瓶培养中和菌体液体扩大培养中的液体摇瓶培养基和液体菌种培养基均为：葡萄糖5～30克/升，蛋白胨0～5克/升，酵母膏0～5克/升，硫酸镁0.2～1克/升，吐温80 0.5～10克/升，磷酸二氢钾2～9克/升，pH5～8，120～140℃灭菌20～40分钟;其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子(1×106)于装有40～120 mL培养基的250mL三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时;其中所述的一级种子培养工艺为，按1～20%(体积比)的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18～72小时;
本发明所述的降解含有蒽醌类化合物的废水工艺为，含有蒽醌类化合物的废水经过浓缩或稀释使蒽醌类化合物浓度达到1～50克/升废水1000L，葡萄糖5～30千克，黄豆饼粉0.5～2千克;硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按此比例放大;其中所述的降解工艺为：按2～20%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养36～168小时。
使用该工艺废水降解后，蒽醌类化合物去除率可达到60-100%。
根据本发明所述的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识，可以根据生产需要，增加二级、三级甚至四级种子罐，进一步扩大生产规模，以进行工业化生产。二级、三级甚至四级种子罐采用的培养基与摇瓶培养基和一级种子培养基相同，接种量为5～20%，培养条件同于液体菌种扩大培养条件，
本发明的另一目的是提供一种以降解废水的米曲霉和发酵液中分子截留获得的活性成分作为饲料添加剂，其特征是将上述的米曲霉降解的酒厂废水，3000～6000rpm离心5～20分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量5000～10000的膜截留浓缩50～100倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。由于许多文献(刑来君，普通真菌学，1999年)已经报道，米曲霉能够分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、植酸酶、糖化酶等多种酶类，因此推测该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。～100倍，-20℃冷冻干燥，每升废液可以得到2-5克菌丝体和活性分子。这些菌丝体和活性分子可以用作饲料添加剂。
具体实施方式
根据此工艺采用的蒽醌类化合物测定方法为：精密吸取1，8-二羟基蒽醌对照品溶液(0.522 mg/ml)1、3、5、8、10、15 ml，分别置25ml容量瓶中，挥去甲醇，残渣用0.5%醋酸镁乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，于425 nm 处，以0.5%醋酸镁乙醇溶液作参比测定吸收度。以1，8-二羟基蒽醌含量(y)对吸收度(x)进行线性回归分析，得线性回归方程。精密吸取样品溶液重复上述操作测定吸收度，利用线性回归方程计算各样品中总蒽醌的含量。
蒽醌类化合物去除率Re按下列公式(1)计算：
()()()((1)
式中，Rt为t时间蒽醌类化合物的去除率;C0 (mg/L) 为0小时的蒽醌类化合物浓度;Ct (mg/L ) 为吸附t小时蒽醌类化合物的浓度。
为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例，但是这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉菌种(中国普通微生物菌种保藏管理中心CCGMC3.5232)，26℃，培养时间50小时;4℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖5克，蛋白胨0克，酵母膏5克，硫酸镁0.2克，吐温80 0.5克，磷酸二氢钾2克，水1000 mL, pH 5，分装250mL三角瓶，每瓶50克，共20瓶，120 ℃灭菌 40分钟;冷却后，每瓶接入一环4℃保存的米曲霉菌种，在25℃，150转/分，培养 72小时;
3. 一级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖50克，蛋白胨0克，酵母膏50克，硫酸镁2克，吐温80 5克，磷酸二氢钾20克，水10L，装于15L的种子罐中，120℃灭菌20分钟;灭菌冷却后，在温度25 ℃，搅拌转速50 转/分，通气量0.2 ：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养 72小时;
4. 废水降解
以大黄为原料，采用水煎法提取蒽醌类化合物的废液经过浓缩，蒽醌类化合物浓度为1克/L的废液1000L，葡萄糖5千克，黄豆饼粉0.5千克;硫酸铜5克，硫酸亚铁5克，硫酸锰5克，;接入2%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度25℃，搅拌转速60转/分，通气量0.3：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养44小时后，蒽醌类化合物去除率达到60.2%。
5. 菌体与活性物质提取
上述的米曲霉降解的蒽醌类化合物废水，3000rpm离心6分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量5000的膜截留浓缩50倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。每升废液可以得到菌体和胞外活性成分共重4.9千克。
实施例2
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC30155)，30℃，培养时间100小时;7℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖150克，蛋白胨25克，酵母膏25克，，硫酸镁0.4克，吐温80 4克，磷酸二氢钾5克，水10 L, pH 6，分装250mL三角瓶，每瓶100克，共100瓶，130℃灭菌30分钟;冷却后，每瓶接入一环7℃保存的米曲霉菌种，在30℃，150转/分，培养50小时;
3. 一级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖2000克，蛋白胨250克，酵母膏250克，硫酸镁60克，吐温80 60克，磷酸二氢钾400克，水100L，装于130L的种子罐中，130℃灭菌30分钟;冷却后，在温度30℃，搅拌转速125转/分，通气量1：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养50小时;
4. 废水降解
尖孢镰刀菌发酵制备蒽醌类化合物的废液，经过浓缩使蒽醌类化合物的含量达到0.2克/L的废水1000L，葡萄糖20千克，黄豆饼粉1.2千克;硫酸铜10克，硫酸亚铁10克，硫酸锰12克;按13%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度30℃，搅拌转速120转/分，通气量1：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养100小时。 此时蒽醌类化合物去除率达到80.3%。
5. 粗酶制品的制备
米曲霉降解的蒽醌类化合物废水，4500rpm离心15分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量8000的膜截留浓缩70倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。菌体和胞外活性成分共重3.5千克。
实施例3
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉菌种(中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC2001)，35℃，培养时间144小时;10℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖300克，蛋白胨50克，酵母膏0克，硫酸镁10克，吐温80 100克，磷酸二氢钾90克，水10L, pH7.5，分装250mL三角瓶，每瓶120 mL，共80瓶， 140℃灭菌20分钟;冷却后，每瓶接入一环10℃保存的米曲霉菌种，在35℃，150转/分，培养72小时;
3. 一级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖1500克，蛋白胨250克，酵母膏0克，硫酸镁50克，吐温80 500克，磷酸二氢钾450克，水50L，装于70L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟;灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养50小时;
4. 二级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖15000克，蛋白胨2500克，酵母膏0克，硫酸镁500克，吐温80 5000克，磷酸二氢钾4500克，水500L，装于700L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟;灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18小时;
5. 废水降解
以蒽醌类化合物为原料，在催化剂的作用下，合成硝基蒽醌的废液，稀释至蒽醌类化合物含量为0.05克/L的废液1000L，葡萄糖30千克，黄豆饼粉1.8千克;硫酸铜15克，硫酸亚铁15克，硫酸锰20克，按20%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度34℃，搅拌转速190转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养168小时。蒽醌类化合物去除率达到100%。
6. 粗酶制品的制备
米曲霉降解的蒽醌类化合物废水， 6000rpm离心20分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量10000的膜截留浓缩100倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。菌体和胞外活性成分共重2.4千克。