申请日2013.09.09
公开(公告)日2013.12.25
IPC分类号A23K1/16; C02F3/34
摘要
本发明公开了一种米曲霉降解废水中没食子酸工艺技术，涉及生物工程领域。即利用米曲霉作为出发菌株，通过液体摇瓶培养、液体菌种扩大培养、菌液转接到含有没食子酸废水并补充一定的营养物质，进行发酵培养。采用此工艺没食子酸去除率可以达到60～100%，同时可以获得用作饲料添加剂的菌体和活性分子。
权利要求书
1.一种米曲霉降解没食子酸废水工艺技术，其特征在于按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、菌体液体扩大培养，液体发酵去除废水中没食子酸，没食子酸去除率可以达到60～100%。
2.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸废水工艺技术，其特征在所用的菌种是米曲霉的任意一株菌种。
3.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在所适用的废水是任意一种含没食子酸的废水，如发酵法生产没食子酸的废液、从植物中提取没食子酸的废液或者以没食子酸为原料合成其他产品的废液。
4.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的试管扩大培养中的扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基。
5.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的液体摇瓶培养中和菌体液体扩大培养中的液体摇瓶培养基和液体菌体培养基均为：葡萄糖5～30克/升，蛋白胨0～5克/升，酵母膏0～5克/升，硫酸镁0.2～1克/升，吐温-80 0.5～10克/升，磷酸二氢钾2～9克/升，pH5～8，120～140℃灭菌20～40分钟。
6.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种3-5块米曲霉试管斜面菌体(5×5mm)于装有40～120 mL培养基的250mL三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时。
7.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，其特征在其中所述的菌体培养工艺为，按1～20%(体积比)的接种量将摇瓶培养种子液接种到液体菌体扩大培养中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18～72小时。
8.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸废水工艺技术，其特征在所述的含有没食子酸废水培养基为：含有没食子酸的废水经过浓缩或稀释使没食子酸浓度达到1～50克/升废水1000L，葡萄糖5～30千克，黄豆饼粉0.5～2千克;硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按此比例放大。
9.根据权利要求1所述的一种米曲霉降解没食子酸废水工艺技术，其特征在其中所述的降解废水工艺为：按2～20%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养36～168小时，即可降解没食子酸。
10.根据权利要求书1获得的降解废水经过3000～6000rpm离心5～20分钟，得到米曲霉菌丝体，菌丝体烘干，保存;
滤液经过分子量5000～10000膜截留浓缩50～100倍，-20℃冷冻干燥，每升废液可以得到2-5克菌丝体和活性分子。
说明书
一种米曲霉降解废水中没食子酸工艺技术
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特指利用米曲霉降解含有没食子酸的废水。将原废水浓缩或稀释至没食子酸含量在1～50克/升后，补充培养基成分，接入米曲霉菌种降解废水中的没食子酸。米曲霉降解后，没食子酸的去除率可达到60～100%，BOD去除率达到90～99%，同时降解后的废水可以提取出菌丝体和活性成分用作饲料添加剂。
背景技术
天然水体中溶解性有机物(Dissolved organic matter，DOM)的主要成分是天然有机酸(Natural organic acids，NOA)，而天然有机酸中15%一30%是亲水性小分子有机酸，没食子酸作为自然界普遍存在的亲水性小分子有机酸，在饮用水净化过程中会带来以下问题：1)影响水的色度、口感和气味：2)在氯消毒过程中形成消毒副产物(Disinfection byproducts，简称DPBs)，如三氯甲烷、卤乙酸类，它们在水体中和氯结合后可以对生物体尤其是人类肝、肾和中枢神经系统造成损害，有致癌、致畸、致突变作用;3)在后续水的深度处理过程中会容易导致膜的污染。没食子酸也是食品加工、日化、医药生产过程中所用的重要原料，生产过程中所排废水含有大量没食子酸，其在水体中会分解产生有机酸及沼气等，消耗水中溶解氧，致使鱼虾等水生生物缺氧而死亡;导致水体COD升高等，由此带来一系列的水生态环境问题。因此高效降解水体中没食子酸成为水污染控制的一个重要方面。
目前关于含有没食子酸废水的处理专利有几项，但是主要是水洗或碱提取等方法，如专利没食子酸生产废渣回收处理方法(申请号200610086067.7),保护了废渣在90~100度下两次水洗，两次压榨的方法回收没食子酸的方法;专利没食子酸母液回收处理工艺(专利号200910226622.5)保护了利用碱提取没食子酸酸，然后调节pH8.0-9.0沉淀得到没食子酸粗品的工艺;专利没食子酸生产废水、废渣、废碳回收处理新技术(专利申请号201210469098.6)公开了生产没食子酸的废渣、废炭采用逆流二次水洗一次挤压法回收没食子酸工艺;专利一种处理没食子酸的粗制废液的方法(申请号2010136553.1)以及文章“Fenton反应-中和-生物法处理没食子酸粗制废液”(杂志“水处理技术”2010年，36卷第9期，pp106-109)，公开了没食子酸粗制废液经过催化氧化、调节pH沉淀、活性炭吸附、最后经过稀释曝气处理的方法，这些方法都存在处理不完全，或用大量的水稀释。
本发明人经过深入的研究，摸索出一种以米曲霉(Aspergillus oryzae)作为出发菌株，降解含有没食子酸废水的方法。该方法不同于过去的方法在于所使用的菌种是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、 我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种，降解废水中没食子酸，同时得到菌体蛋白和含有一种或几种酶制剂(糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶)等发酵液的活性成分。这些菌体和活性成分可以作为饲料添加剂。
发明内容
本发明提供的是米曲霉降解废水中没食子酸的生物技术。废水经过米曲霉降解后，其没食子酸去除率可到达60~100%。
本发明一种米曲霉降解没食子酸工艺技术，按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、菌体液体扩大培养，离心收集菌体，然后通过发酵降解废水中没食子酸。降解后的废水经过离心获得的米曲霉菌丝体，滤液经过分子截留获得多种生物活性分子，这些菌丝体和生物活性分子可以用在饲料添加剂中。
本发明所用的菌种是米曲霉任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。
本发明所适用的废水是任意一种含没食子酸的废水，如发酵法生产没食子酸的废液、从植物中提取没食子酸的废液或者以没食子酸为原料合成其他产品的废液。
其中所述的试管扩大培养中的试管扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页。
其中所述的液体摇瓶培养中和菌体液体扩大培养中的液体摇瓶培养基和液体菌种培养基均为：葡萄糖5～30克/升，蛋白胨0～5克/升，酵母膏0～5克/升，硫酸镁0.2～1克/升，吐温80 0.5～10克/升，磷酸二氢钾2～9克/升，pH5～8，120～140℃灭菌20～40分钟;其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子(1×106)于装有40～120 mL培养基的250mL三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时;其中所述的一级种子培养工艺为，按1～20%(体积比)的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18～72小时;
本发明所述的降解含有没食子酸的废水工艺为，含有没食子酸的废水经过浓缩或稀释使没食子酸浓度达到1～50克/升废水1000L，葡萄糖5～30千克，黄豆饼粉0.5～2千克;硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按此比例放大;其中所述的降解工艺为：按2～20%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养36～168小时。
使用该工艺废水降解后，没食子酸去除率可达到60-100%。
根据本发明所述的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识，可以根据生产需要，增加二级、三级甚至四级种子罐，进一步扩大生产规模，以进行工业化生产。二级、三级甚至四级种子罐采用的培养基与摇瓶培养基和一级种子培养基相同，接种量为5～20%，培养条件同于液体菌种扩大培养条件，
本发明的另一目的是提供一种以降解废水的米曲霉和发酵液中分子截留获得的活性成分作为饲料添加剂，其特征是将上述的米曲霉降解的酒厂废水，3000～6000rpm离心5～20分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量5000～10000的膜截留浓缩50～100倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。由于许多文献(刑来君，普通真菌学，1999年)已经报道，米曲霉能够分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、植酸酶、糖化酶等多种酶类，因此推测该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。～100倍，-20℃冷冻干燥，每升废液可以得到2-5克菌丝体和活性分子。这些菌丝体和活性分子可以用作饲料添加剂。
具体实施方式
根据此工艺采用的没食子酸测定方法为：精密称取没食子酸对照品10.3 mg，置于100 mL 烧杯中，用色谱级甲醇溶解，并定容至100mL 容量瓶中， 配制成10.3mg/mL的标准储备液。临用时用0.45μm微孔滤膜过滤，控制进样量为2，4，6，8，10μl，利用高效液相色谱仪(HIMADZU(岛津) LC-20AT)测定没食子酸含量。色谱柱为AlltimaTMC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。测定条件为流动相：甲醇：0.1%磷酸溶液=10：90;柱温：30℃，流速：0.8 mL/min，检测波长：270 nm。以进样量为横坐标(X)，以相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，求得没食子酸浓度与峰面积的线性回归方程。吸取样品液(降解前和降解过程中以及降解后)的上清液少量，用0.45μm微孔滤膜过滤，按上述色谱条件分别测定峰面积，采用外标峰面积根据上述求得的没食子酸浓度与峰面积的回归方程计算没食子酸含量。
没食子酸去除率Re按下列公式(1)计算：
()()()((1)
式中，Rt为t时间没食子酸的去除率;C0 (mg/L) 为0小时的没食子酸浓度;Ct (mg/L ) 为吸附t小时没食子酸的浓度。
为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例，但是这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种(中国普通微生物菌种保藏管理中心CCGMC3.5232)，26℃，培养时间50小时;4℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖5克，蛋白胨0克，酵母膏5克，硫酸镁0.2克，吐温80 0.5克，磷酸二氢钾2克，水1000 mL, pH 5，分装250mL三角瓶，每瓶50克，共20瓶，120 ℃灭菌 40分钟;冷却后，每瓶接入一环4℃保存的米曲霉菌种，在25℃，150转/分，培养 72小时;
3. 一级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖50克，蛋白胨0克，酵母膏50克，硫酸镁2克，吐温80 5克，磷酸二氢钾20克，水10L，装于15L的种子罐中，120℃灭菌20分钟;灭菌冷却后，在温度25 ℃，搅拌转速50 转/分，通气量0.2 ：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养 72小时;
4. 废水降解
以五倍子为原料，采用高温高压和碱提取没食子酸的废液经过浓缩，没食子酸浓度为50克/L的废液1000L，葡萄糖5千克，黄豆饼粉0.5千克;硫酸铜5克，硫酸亚铁5克，硫酸锰5克，;接入2%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度25℃，搅拌转速60转/分，通气量0.3：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养44小时后，没食子酸去除率达到60.2%。
5. 菌体与活性物质提取
上述的米曲霉降解的没食子酸废水，3000rpm离心6分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量5000的膜截留浓缩50倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。每升废液可以得到菌体和胞外活性成分共重4.9千克。
实施例2
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC30155)，30℃，培养时间100小时;7℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖150克，蛋白胨25克，酵母膏25克，，硫酸镁0.4克，吐温80 4克，磷酸二氢钾5克，水10 L, pH 6，分装250mL三角瓶，每瓶100克，共100瓶，130℃灭菌30分钟;冷却后，每瓶接入一环7℃保存的米曲霉菌种，在30℃，150转/分，培养50小时;
3. 一级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖2000克，蛋白胨250克，酵母膏250克，硫酸镁60克，吐温80 60克，磷酸二氢钾400克，水100L，装于130L的种子罐中，130℃灭菌30分钟;冷却后，在温度30℃，搅拌转速125转/分，通气量1：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养50小时;
4. 废水降解
以五倍子为原料通过黑曲霉发酵制备没食子酸的废母液，经过浓缩是没食子酸的含量达到25克/L的废水1000L，葡萄糖20千克，黄豆饼粉1.2千克;硫酸铜10克，硫酸亚铁10克，硫酸锰12克;按13%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度30℃，搅拌转速120转/分，通气量1：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养100小时。 此时没食子酸去除率达到80.3%。
5. 粗酶制品的制备
米曲霉降解的没食子酸废水，4500rpm离心15分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量8000的膜截留浓缩70倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。菌体和胞外活性成分共重3.5千克。
实施例3
1. 试管斜面菌种的制作
在新配置的马铃薯蔗糖培养基(诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页)中接入一环米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种(中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC2001)，35℃，培养时间144小时;10℃保存备用。
2. 液体摇瓶培养菌种的制作
精确称取葡萄糖300克，蛋白胨50克，酵母膏0克，硫酸镁10克，吐温80 100克，磷酸二氢钾90克，水10L, pH7.5，分装250mL三角瓶，每瓶120 mL，共80瓶， 140℃灭菌20分钟;冷却后，每瓶接入一环10℃保存的米曲霉菌种，在35℃，150转/分，培养72小时;
3. 一级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖1500克，蛋白胨250克，酵母膏0克，硫酸镁50克，吐温80 500克，磷酸二氢钾450克，水50L，装于70L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟;灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养50小时;
4. 二级液体菌种的制作
精确称取葡萄糖15000克，蛋白胨2500克，酵母膏0克，硫酸镁500克，吐温80 5000克，磷酸二氢钾4500克，水500L，装于700L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟;灭菌冷却后，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养18小时;
5. 废水降解
以微晶纤维素、没食子酸为原料,在催化剂的作用下,采用直接酯化法合成没食子酸微晶纤维素酯的废液，稀释至没食子酸含量为1克/L的废液1000L，葡萄糖30千克，黄豆饼粉1.8千克;硫酸铜15克，硫酸亚铁15克，硫酸锰20克，按20%(种子液体积/废水体积)接种一级液体菌种，在温度34℃，搅拌转速190转/分，通气量2：1体积/体积/分钟(通气气体体积/发酵液体积/分钟)，培养168小时。没食子酸去除率达到100%。
6. 粗酶制品的制备
米曲霉降解的没食子酸废水， 6000rpm离心20分钟，获得菌丝体，菌丝体烘干，保存。滤液，通过分子量10000的膜截留浓缩100倍，-20℃冷冻干燥，得到大分子的活性成分。该活性成分含有以下一种或几种酶：如糖化酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶。菌体和胞外活性成分共重2.4千克。