申请日2016.06.14
公开(公告)日2016.11.09
IPC分类号C12N1/21; C07K14/00; A01N63/00; A01P1/00; A01P3/00; A01P13/00; C12R1/02
摘要
本发明涉及一种养殖污水的处理方法，其包括在养殖水体中添加水体处理的菌剂，该菌剂中的菌为非脱羧莱克勒菌。所述的菌具有杀灭多种养殖水体中污染菌的效果，同时还能够有效去除水华中的有毒藻类，对于水产养殖有很好的应用前景。
权利要求书
1.一种养殖污水的处理方法，其特征在于，在养殖水体中添加水体处理的菌剂，其特征在于：所述的菌剂中的菌为非脱羧莱克勒菌。
2.一种养殖污水的处理方法，其特征在于，在养殖水体中添加水体处理的菌剂，其特征在于：所述的菌剂中的菌为导入了编码氨基酸序列如SEQIDNo:1所示蛋白的基因的保藏编号为 CGMCC No:7813的非脱羧莱克勒菌，或者为导入了在SEQIDNo:1的基础上进行的如下任意一突变：Val29Ser，Gly46Lys，Lys79Gly，Ser106Val，Ser244Leu，Glu311Ser，Ala345Gly，Asn356Lys，Ala371Met，Lys456Cys，Asp471Gly，Trp486Ala，Gly490Ser，Asn500Ile，Asn516Cys，Ala533Ser，Ala545Trp，Leu552Ser或Pro566Ser的蛋白的基因的保藏编号为 CGMCC No:7813的非脱羧莱克勒菌。
3.一种蛋白变体，其特征在于：其氨基酸序列为在SEQIDNo:1的基础上仅进行如下任意一突变：Val29Ser，Gly46Lys，Lys79Gly，Ser106Val，Ser244Leu，Glu311Ser，Ala345Gly，Asn356Lys，Ala371Met，Lys456Cys，Asp471Gly，Trp486Ala，Gly490Ser，Asn500Ile，Asn516Cys，Ala533Ser，Ala545Trp，Leu552Ser或Pro566Ser。
说明书
一种养殖污水的处理方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体地说，涉及一种养殖污水的处理方法。
背景技术
随着水产养殖集约化程度不断提高，养殖水体的理化环境和生态环境日趋恶化;同时，人类生活污水、各种工业废水、农业退水等的超量排放，也加剧了养殖水体质量的下降;这些问题造成养殖病害日趋严重。抗生素和化学药品的滥用不仅使病原微生物的耐药性增强，而且导致水产品的有害残留超标，直接威胁人类的健康。美国和欧盟等国家和地区相继出台了相关法律限制抗生素在水产养殖上的应用，因此，水产养殖必须提供安全、优质的无公害绿色的水产品是大势所趋。已有的研究结果表明微生态制剂不仅能降低水体的有机污染，净化水体，还可抑制、杀死病原微生物，并可作为食料添加剂，从而部分替代或完全替代化学药品和抗生素的使用。而复合微生态制剂由于同时具有改善肠道内环境、增加进食、抑制有害菌群、改善水质等多方面的作用，在水产动物养殖中的应用逐渐成为研究热点。
上世纪80年代日本琉球大学的比嘉昭夫教授成功研制了复合微生态制剂EM，我国于上世纪90年代开始将微生态制剂应用于水产养殖业，随着研究工作的开展，相关产品也相继问世，用于水产养殖方面的主要有CM、MCB、益生净水复合菌、"甘菌露"、"片片绿"、免疫利生剂、保水宁等。虽然已有的大多数复合微生态制剂在水质改良和预防疾病某一或某些方面取得了比较明显的效果，但是国产制剂由于存在菌种性能不稳定、功能单一和环境适应性差等问题使其不能适应水体复杂多变的环境，施于水体后效果不稳定，从而限制了微生态制剂在水产养殖上的推广应用。
现有技术中公开了分离自肠道内的益生菌非脱羧莱克勒菌，该菌在水产养殖中可以用于杀灭有害菌，具有很好的应用前景，但是该菌的杀菌效果还不是非常高，有待于进一步的优化。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对上述现有技术的菌，提供一种改造的具有更加光谱的杀菌和杀藻特性的的微生物制剂及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种处理城市生活污水的微生物制剂，每毫升所述微生物菌剂中包含有活菌数2-6*109，其中所述活菌含有改造后的非脱羧莱克勒菌。
本发明所述的微生物制剂中的菌为保藏编号为CGMCC No:7813的菌通过导入了特定的蛋白后获得的。
本发明中导入的蛋白为大小为571aa的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示或者在序列1的基础上进行的如下突变：Val29Ser，Gly46Lys，Lys79Gly，Ser106Val，Ser244Leu，Glu311Ser，Ala345Gly，Asn356Lys，Ala371Met，Lys456Cys，Asp471Gly，Trp486Ala，Gly490Ser，Asn500Ile，Asn516Cys，Ala533Ser，Ala545Trp，Leu552Ser或Pro566Ser。
申请人针对SEQ ID No:1序列共进行了270个定点突变，其中仅仅筛选得到19个突变具有提高的杀菌活性，而其余的都没有或者活性大幅度的降低，这也说明突变的筛选并不是容易获得的。
非脱羧莱克勒菌还采用基因工程的方式构建了基因工程菌。利用DNAMAN软件分析，根据氨基酸序列SEQID NO:1所示全基因合成所述的核苷酸序列KST基因，通过进行扩增获得目的片段，PCR扩增获得目的基因KST(同时通过多重PCR将相应的突变位点Val29Ser，Gly46Lys，Lys79Gly，Ser106Val，Ser244Leu，Glu311Ser，Ala345Gly，Asn356Lys，Ala371Met，Lys456Cys，Asp471Gly，Trp486Ala，Gly490Ser，Asn500Ile，Asn516Cys，Ala533Ser，Ala545Trp，Leu552Ser或Pro566Ser分别引入到基因序列中，从而获得了不同突变体基因)，用限制性内切酶进行双酶切PCR产物，与同样经过双酶切的表达载体pSDK-1相连，先将pSDK-1导入大肠杆菌中，通过本领域常用的质粒转移的方式(参见“大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在氧化硫硫杆菌中的克隆、表达及其对有机质代谢的分析”中所述的方法，在此不一一表述)将验证成功的重组质粒从大肠杆菌中转化进入到所述非脱羧莱克勒菌中，获得了所述的基因工程菌。该工程菌具有更好的应用前景。
本发明的非脱羧莱克勒菌为CGMCC No:7813的非脱羧莱克勒菌。
本发明的微生物菌剂，对养殖水体处理效果明显，具有极强的杀菌和杀藻效果，应用前景广阔。
具体实施方式
实施例1 非脱羧莱克勒菌抗菌性检验
(1)抗菌性检测
a)病原菌平板制备：将白色念球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌用LB液体培养基于37℃，将副溶血弧菌、哈市弧菌用2216E液体培养基于28℃培养至OD 600=O.8-1.0，取100-200ul培养液，6000-8000rpm室温离心3-5min，弃上清，沉淀用100-200ul无菌PBS重新悬浮。将白色念球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌悬浮液涂布在LB固体培养基平板于37℃，将副溶血弧菌、哈市弧菌悬浮液涂布在2216E固体培养基于28℃，分别正置固定2-3h。
b)点种：将CGMCC No:7813的非脱羧莱克勒菌取用2216E液体培养基培养培养至OD600=O.8-1.0、无菌PBS、无菌水各10-30ul，分别点在涂满病原菌的上述平板上。28-30℃正置2-3h，待点种液被培养基吸收后，置于28℃或37℃的培养箱中倒置过夜培养24-48h。
(2)杀藻性检测
将购买的铜绿微囊藻藻种于2000LX、25℃条件下的光照培养箱中静置培养，每隔3h人工摇动一次(均在无菌条件下进行)，持续预培养一周，并镜检有无杂藻和藻类生长情况，如达到同步良好生长，就可作为试验的藻种液。
铜绿微囊藻按照本领域常规的藻类培养方法，培养得到藻液。分别将150μL(1)b中培养的非脱羧莱克勒菌菌体悬液、发酵上清液接种于30mL四种藻液中，对照Control为Landy培养基,进行溶藻实验，7d后测定叶绿素a含量，计算抑藻率。
(3)结果：对照无菌PBS和无菌水的结果，观察非脱羧莱克勒菌在各病原菌平板上的生长及抑菌圈的产生情况。发现对于所检测的细菌，非脱羧莱克勒菌都产生了明显的抑菌圈。而无菌PBS和无菌水则未见明显的抑菌圈产生。同时，非脱羧莱克勒菌发酵液的抑藻率很低。表明非脱羧莱克勒菌几乎没有溶藻作用。
效果统计表
注：“+++”抑菌圈的直径为0.8-1.3cm，“++”的抑菌圈直径为0.6-0.8cm，“+”的抑菌圈直径为0.4-0.6cm，“-”无抑菌圈产生。
实施例2基因工程菌非脱羧莱克勒菌的制备
利用DNAMAN软件分析，根据氨基酸序列SEQID NO:1所示全基因合成所述的核苷酸序列KST基因，通过进行扩增获得目的片段，PCR扩增获得目的基因KST(同时通过多重PCR将相应的突变位点Val29Ser，Gly46Lys，Lys79Gly，Ser106Val，Ser244Leu，Glu311Ser，Ala345Gly，Asn356Lys，Ala371Met，Lys456Cys，Asp471Gly，Trp486Ala，Gly490Ser，Asn500Ile，Asn516Cys，Ala533Ser，Ala545Trp，Leu552Ser或Pro566Ser分别引入到基因序列中，从而获得了不同突变体基因)，用限制性内切酶进行双酶切PCR产物，与同样经过双酶切的表达载体pSDK-1相连，先将pSDK-1导入大肠杆菌中，通过本领域常用的质粒转移的方式将验证成功的重组质粒从大肠杆菌中转化进入到所述保藏号CGMCC No:7813的非脱羧莱克勒菌中，获得了所述的基因工程菌。导入突变的KST基因的菌分别命名为非脱羧莱克勒菌-KST1、非脱羧莱克勒菌-KST2、非脱羧莱克勒菌-KST3、非脱羧莱克勒菌-KST4、非脱羧莱克勒菌-KST5、非脱羧莱克勒菌-KST6、非脱羧莱克勒菌-KST7、非脱羧莱克勒菌-KST8、非脱羧莱克勒菌-KST9、非脱羧莱克勒菌-KST10、非脱羧莱克勒菌-KST11、非脱羧莱克勒菌-KST12、非脱羧莱克勒菌-KST13、非脱羧莱克勒菌-KST14、非脱羧莱克勒菌-KST15、非脱羧莱克勒菌-KST16、非脱羧莱克勒菌-KST17、非脱羧莱克勒菌-KST18、非脱羧莱克勒菌-KST19。分别对应于导入基因的Val29Ser，Gly46Lys，Lys79Gly，Ser106Val，Ser244Leu，Glu311Ser，Ala345Gly，Asn356Lys，Ala371Met，Lys456Cys，Asp471Gly，Trp486Ala，Gly490Ser，Asn500Ile，Asn516Cys，Ala533Ser，Ala545Trp，Leu552Ser或Pro566Ser突变。
实施实例3：非脱羧莱克勒菌效果验证
按照实施例1的方法，进行相应的效果处理实验，结果如下：
从以上结果可以看出，采用基因工程构建的非脱羧莱克勒菌与原始菌株相比具有增强的杀菌效果，而且，具有杀灭藻类的效果，这在水产养殖中具有较好的应用前景。
实施实例4：养殖水体实验验证
在小龙虾养殖水体中，添加非脱羧莱克勒菌KST1菌制备的菌剂，水体中菌的浓度达到3*103个/ml，反应3天后，测量水体中各种菌和藻类的含量，发现水体中弧菌的杀菌率达到95%，藻类的杀菌率达到86%，具有较好的效果。采用其他突变的非脱羧莱克勒菌KST2-19任一种菌，其杀菌效果也都近似。
将所述的菌制备成为相应的菌剂，可以大面积的用于水产养殖中菌和藻类的杀灭中去，具有极大的应用前景。