过氧化物酶是一类含血红素的氧化还原酶，能够以过氧化氢为电子受体氧化多种有机和无机分子，在免疫检测、生物传感器、工业废水处理等方面有着广阔的应用前景。目前使用的大多数过氧化物酶来源于植物，其生产受地域和气候的限制，给工业应用带来不便。灰盖鬼伞过氧化物酶因与辣根过氧化物酶在酶学特性和底物广谱性上十分相似而引起了人们的广泛关注，尽管二者同源性低于10%−16%。研究发现，CIP已经成功用于清除废水中的酚类物质、降解苯类同系物及衍生物、染料脱色;生产功能性多聚芳香物;用作生物传感器和清洁剂;此外，CIP在纸浆造纸工业也极具应用潜力。从商业角度看，CIP有望替代HRP成为工业用酶，有着广阔的市场前景。
近年来酶法处理染料废水因条件温和、环境友好而发展迅速，漆酶、过氧化物酶被广泛试用于染料脱色。令人遗憾的是染织工业废水pH大多是中性甚至碱性，漆酶和过氧化物酶却多为酸性酶，在中碱性条件下会快速失活;而CIP的最适反应pH接近中性，热稳定性比HRP更强，相对于其它酶CIP更适合用作染织业废水脱色处理。美中不足的是灰盖鬼伞属于中温菌，其产生的CIP在高温和碱性环境下不够稳定。利用分子定向进化技术进行CIP酶学性质的分子改良是改变最适反应pH、提高酶的热稳定性和碱性环境耐受性的重要途径Cherry等利用定向进化技术得到了一个氧化稳定性提高100倍、热稳定性提高174倍的突变CIP;Houborg等研究了该突变体酶的晶体结构，揭示了蛋白结构改变对酶学性质的影响。但是该突变酶在高温下仍不够稳定，40°C处理5min活性下降为87%。目前国际上尚没有关于CIP的最适反应pH向中、碱性方向偏移，最适反应温度大幅提高且高温稳定性增强的分子定向进化研究。
Cherry等报道M166F和M242I能够提高CIP的氧化稳定性，V53A可以提高酶活性;Houborg等研究晶体结构时提出I49S和V53A会协同发生作用。本文以含有4个氨基酸突变(I49S、V53A、M166F和M242I)的CIP基因为模板，在保证了氧化稳定性和提高酶活性的基础上进行基于易错PCR的定向进化，以期寻找最适反应pH向中、碱性方向偏移，最适反应温度升高，更适应染料脱色处理的工业用CIP。
染料脱色实验
选pH2.2−8.0的柠檬酸-磷酸作缓冲液，分别用CIPwt和CIPmt5的粗酶液对7种染料进行脱色能力测定。200mL反应体系含合适初始浓度染料(刚果红7.18mmol/L，氨基黑8.11mmol/L，甲基橙15.28mmol/L，次甲基蓝14.98mmol/L，苯胺蓝6.78mmol/L，结晶紫12.26mmol/L，溴酚蓝7.46mmol/L)，双氧水10mmol/L，CIPwt组酶用量为0.045U/mL，CIPmt5组酶用量为0.042U/mL，室温(25°C)下孵育4h，测量脱色前后染料的浓度，
计算染料脱色率，计算公式如下：脱色率(%)=(脱色前吸光度–脱色后吸光度)/脱色前吸光度×100。
每个实验3个重复，刚果红、氨基黑和甲基橙采用490nm波长，次甲基蓝和苯胺蓝采用405nm波长，结晶紫和溴酚蓝采用630nm波长，脱色率最高的缓冲液pH被认定为最适pH。具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
讨论
酵母在表达含稀有密码子的外源基因时，细胞中氨酰tRNA对氨基酸的正常转运可能受到限制，致使翻译提前终止。大量实验证明，密码子优化可以显著提高蛋白在酵母中的表达[37,39]。在实验中将CIP密码子调整为毕赤酵母偏好性，保证了突变CIP能够在酵母中成功表达并完成表达后的翻译、翻译后加工、分泌等过程。根据Cherry等的报道向CIP中引入了4个氨基酸突变，为定向进化奠定了基础，使得到的酶有可能在最适反应pH向中、碱性方向偏移，最适反应温度升高的同时保持氧化稳定性。Cherry等对CIP进行定向进化时发现单个V53A可以提高酶活性，但不会引起稳定性的改变，而M166F似乎和I49S、V53A协同发生作用，对稳定性增强贡献最大。用Swiss-model建模分析发现I49S、V53A导致酶蛋白缺失一个与原卟啉IX结合的氰根离子配体，使突变酶活性中心更开放，所以表现出Km值下降，亲和力增强。第49、53和121位的3个疏水性氨基酸同时变成亲水性氨基酸，使蛋白侧链变小，从而增加了蛋白的稳定性。分子动力学模拟进一步验证了这一观点。Cherry等分析E239G能够改善CIP在高pH时的热稳定性，而本实验在定向进化中得到了一个含有E239G的突变3-26-G5(I49S、V53A、M166F、E239G、M242I和Y272F)，最适反应pH为6.5，酶活性是野生型的1.13倍(13.74U/mg)，最适反应温度为40°C，但是后期实验发现其在各pH和温度处理后稳定性尚不如野生型(数据未显示)。E239G的引入并没有提高热稳定性，可能是各突变位点之间存在着复杂的相互作用，机理仍需进一步研究。
染料废水处理是环境保护领域的一大难题，理化方法成本昂贵且会形成二次污染;酶法处理染料逐渐引起人们的重视。植物来源的过氧化物酶生产周期长、成本高不适合工业化应用。而真菌来源的漆酶和过氧化物酶多为酸性酶，在中、碱性环境会快速失活。本实验用定向进化的手法得到了酶学性质显著改善的突变灰盖鬼伞过氧化物酶，并对不同类型的7种常用染织染料进行脱色检测。虽然CIPmt5可能会在较高温度时(比如37°C和45°C)具有更高的活性和高的脱色效率，但考虑到室温能耗低、利于降低处理成本，因此选择了在室温(25°C)下对染料进行处理。因酶法脱色染料反应体系和条件不同，无法与其他人的具体结果进行比较，从本实验结果来看突变后的酶取得了比野生型酶更好的脱色效果，反应条件更接近实际排放的染料工业废水状况，从方法的适应性和节约成本出发，CIPmt5更适合染料工业废水的处理应用。