申请日2013.11.28
公开(公告)日2014.03.05
IPC分类号G01N33/18
摘要
本发明属环境毒理学领域，涉及一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法。它以斑马鱼为测试生物，将其暴露于典型抗生素废水中，通过分析典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性、亚急性毒性，定量地测定典型抗生素废水对斑马鱼的短期或长期毒性效应，急性毒性以96小时半数致死浓度(96h LC50)(典型抗生素废水体积百分比%)描述，亚急性毒性以鱼体生化指标，如超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量等描述。采用该方法可以对典型抗生素废水的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述，解决常规理化指标不能反映的典型抗生素废水生物毒性，同时可作为典型抗生素废水生物毒性监测和评价的指标。
权利要求书
1.一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，其特征是，
该方法采用斑马鱼体内试验方法，分别利用短期即96小时和长期即20 天的暴露方式描述典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性和亚急性毒性，判 断典型抗生素废水对斑马鱼是否具有毒性的判据为：急性毒性以96h LC50描述;亚急性毒性以一组抗氧化指标描述;
利用短期暴露方式，测定得到典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性， 急性毒性测定得到96h LC50;以96h LC50描述急性毒性;
利用长期暴露方式，亚急性毒性以鱼体的一组抗氧化指标表示，然后 利用显著性t检验，检验暴露组与空白对照组间的差异，当t
本测试方法为，如果暴露组与空白对照组差异显著，即0.01 2.如权利要求1所述的利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法， 其特征是，它包括以下具体步骤： (1)准备测试生物，选用斑马鱼为受试生物，雌雄个体各半，斑马鱼经 5%食盐水消毒后，用曝气48h的脱氯自来水在实验室驯养7天，在预实验 前一天和试验期间不予喂食，避免鱼饵对测试结果产生影响; (2)准备测试条件，试验溶液pH值为7.0～8.5;总硬度以CaCO3计为 240～250mg/L，试验温度为23～25℃;溶解氧高于5mg/L;采用自然光 照;试验周期为96h或20d;试验方式为静水式，即每24h更换一次试液， 每天至少测定1次试验溶液的水温、硬度、pH值、溶解氧含量; (3)进行预实验，在50cm×20cm×25cm的玻璃水族缸中，盛放20L 试验溶液，分为5～6个暴露组，暴露组浓度以试验溶液中含典型抗生素废 水的体积百分比表示。三种典型抗生素废水暴露组分别设置如下：青霉素 废水暴露浓度组为5%、10%、15%、20%、25%和30%;土霉素废水暴露 浓度组为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%;链霉素废水暴露浓度 组为1%、3.2%、10%、32%、100%;不设平行组，每个暴露组放5尾斑马 鱼，连续实验96h，每日至少两次记录各容器内的死鱼数并及时取出死鱼; 计算得出预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死亡浓度; 青霉素废水预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死 亡浓度分别为20%和10%; 土霉素废水预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死 亡浓度分别为0.1%和0.5%; 链霉素废水预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死 亡浓度分别为100%和10%; (4)急性毒性测试方法根据所述步骤(3)的测试结果，在24h绝对 致死浓度和最高的96h无死亡浓度之间按等对数间距设置5个暴露组，暴 露组浓度以试验溶液中含典型抗生素废水的体积百分比表示。三种典型抗 生素废水暴露组分别设置如下：青霉素废水暴露浓度组为10%、12.57%、 15.81%、19.88%、24.99%;土霉素废水暴露浓度组为0.1%、0.15%、0.22%、 0.33%、0.5%;链霉素废水暴露浓度组为17.78%、23.71%、31.62%、42.17%、 56.23%;每个暴露组设2个平行组，并设置空白对照组，共计11个组，每 个暴露组随机放入8尾斑马鱼，试验周期为96h，试验结果以半数致死浓 度表示，每隔24h更换1次试验溶液，采用寇式法和概率单位法两种方法 计算得出96h LC50及其95%的置信限; 急性毒性测试结果为：青霉素废水96h LC50为以寇式法计算的13.46% 和以概率单位法计算的13.66%;土霉素废水96h LC50为以寇式法计算的 0.22%和以概率单位法计算的0.19%;链霉素废水96h LC50为以寇式法计算 的25.56%和以概率单位法计算的29.51%; (5)亚急性毒性测试方法参照步骤(4)的测试结果设置亚急性的暴 露组，暴露组浓度在1/6 96h LC50和1/2 96h LC50之间，设置5个暴露组， 青霉素废水、土霉素和链霉素暴露浓度组均为1/256 96h LC50、1/64 96h LC50、1/16 96h LC50、1/4 96h LC50、1/2 96h LC50，暴露组浓度以试验溶液 中含典型抗生素废水的体积百分比表示，每个暴露组设置2个平行组，1 个空白对照组，共计16个组。暴露时间为20天，选取健康的斑马鱼，雌 雄个体各半，每个组15尾斑马鱼，每天换水。5个暴露组分别于第4、8、 12、16和20天取生物样进行分析，每次各暴露组分别取2尾斑马鱼，测 定POD活性、SOD活性和MDA含量，测试结果为暴露组与空白对照组相 比，POD活性、SOD活性和MDA含量有显著差异; 所述试验溶液为典型抗生素废水和除氯自来水的混合溶液。 说明书 一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法 技术领域 本发明属于环境毒理学领域，涉及一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒 性的方法。 背景技术 抗生素废水是一类色度高、含难降解和生物毒性物质多的高浓度有机废水。 2010年7月国家环保部颁布了《制药工业水污染物排放标准》，其中规定了以抗 生素等为主的发酵类制药工业企业水污染物的排放限值、监测和监控要求。涉 及毒性的排放指标只有急性毒性指标(HgCl2毒性当量)，测试方法为发光细菌 法，该指标仅能反映抗生素废水是否对发光菌有毒性，但发光菌为低等生物， 其结果不能代表抗生素废水对高等生物的影响，为此需要寻找新的方法和指标 来评价抗生素废水的生物毒性。 发明内容 本发明为解决现在抗生素废水生物毒性定性和定量评估的问题，提供了一 种采用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法。该方法采用急性毒性、亚急性 毒性测试，定性和定量两种指标描述典型抗生素废水的生物毒性，弥补抗生素 废水生物毒性监测指标的不足。 本发明的思路是，采用短期(96小时)暴露方式，测定得到典型抗生素废 水对斑马鱼的急性毒性，以96h LC50(典型抗生素废水的体积百分比%)描述， 采用长期(20天)暴露方式，亚急性毒性以鱼体的一组抗氧化指标表示。 判断典型抗生素废水对斑马鱼是否具有毒性的判据为：急性毒性测定得到 96h LC50(典型抗生素废水的体积百分比%);亚急性毒性为典型抗生素废水对 斑马鱼鱼体抗氧化指标的影响是否显著。如果暴露组与空白对照组差异显著： 认为典型抗生素废水有亚急性生物毒性。暴露组与空白对照组差异不显著：认 为典型抗生素废水无亚急性生物毒性。依据上述判据评估典型抗生素废水对斑 马鱼的毒性类型以及毒性水平，从而可以确定典型抗生素废水的毒性类型(属 于急性毒性还是亚急性毒性)和毒性水平(毒性的显著性水平)。 本发明采用以下技术方案予以实现： 一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，该方法采用斑马鱼 体内试验方法，分别利用短期(96小时)和长期(20天)暴露方式描述典 型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性和亚急性毒性，判断典型抗生素废水对 斑马鱼是否具有毒性的判据为：急性毒性以96h LC50(典型抗生素废水体 积百分比%)描述;亚急性毒性以一组抗氧化指标描述; 利用短期(96小时)暴露方式，测定得到典型抗生素废水对斑马鱼的 急性毒性，急性毒性测定得到96h LC50(典型抗生素废水体积百分比%); 以96h LC50描述急性毒性; 利用长期(20天)暴露方式，亚急性毒性以鱼体的一组抗氧化指标表 示，然后利用显著性t检验，检验暴露组与空白对照组间的差异，当t 本测试方法为，如果暴露组与空白对照组差异显著(0.01 所述的利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，它包括以下具体 步骤： (1)准备测试生物，选用斑马鱼(Zebra Fish)为受试生物，雌雄个体 各半，斑马鱼经5%食盐水消毒后，用曝气48h的脱氯自来水在实验室驯养 7天，在预实验前一天和试验期间不予喂食，避免鱼饵对测试结果产生影 响; (2)准备测试条件，试验溶液pH值为7.0～8.5;总硬度为240～250 mg/L(以CaCO3计)，试验温度为23～25℃;溶解氧高于5mg/L;采用 自然光照;试验周期为96h(预实验和急性毒性实验持续时间)或20d(亚 急性毒性实验持续时间);试验方式为静水式(每24h更换一次试液)， 每天至少测定1次试验溶液的水温、硬度、pH值、溶解氧含量; (3)进行预实验，在50cm×20cm×25cm的玻璃水族缸中，盛放20L 试验溶液，分为5～6个暴露组，暴露组浓度以试验溶液中含典型抗生素废 水的体积百分比表示。三种典型抗生素废水暴露组分别设置如下：青霉素 废水暴露浓度组为5%、10%、15%、20%、25%和30%;土霉素废水暴露 浓度组为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%;链霉素废水暴露浓度 组为1%、3.2%、10%、32%、100%;不设平行组，每个暴露组放5尾斑马 鱼，连续实验96h，每日至少两次记录各容器内的死鱼数并及时取出死鱼; 计算得出预实验结果：最低的24h绝对致死浓度(典型抗生素废水的体积 百分比%)和最高的96h无死亡浓度(典型抗生素废水的体积百分比%)。 青霉素废水预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死 亡浓度分别为20%(青霉素废水的体积百分比%)和10%(青霉素废水的 体积百分比%)。 土霉素废水预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死 亡浓度分别为0.1%(土霉素废水的体积百分比%)和0.5%(土霉素废水的 体积百分比%)。 链霉素废水预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死 亡浓度分别为100%(链霉素废水的体积百分比%)和10%(链霉素废水的 体积百分比%)。 (4)急性毒性测试方法根据所述步骤(3)的测试结果，在24h绝对 致死浓度(典型抗生素废水的体积百分比%)和最高的96h无死亡浓度(典 型抗生素废水的体积百分比%)之间按等对数间距设置5个暴露组，暴露 组浓度以试验溶液中含典型抗生素废水的体积百分比表示。三种典型抗生 素废水暴露组分别设置如下：青霉素废水暴露浓度组为10%、12.57%、 15.81%、19.88%、24.99%;土霉素废水暴露浓度组为0.1%、0.15%、0.22%、 0.33%、0.5%;链霉素废水暴露浓度组为17.78%、23.71%、31.62%、42.17%、 56.23%。每个暴露组设2个平行组，并设置空白对照组，共计11个组，每 个暴露组随机放入8尾斑马鱼，试验周期为96h，试验结果以半数致死浓 度(典型抗生素废水的体积百分比%)表示，每隔24h更换1次试验溶液， 采用寇式法和概率单位法两种方法计算得出96h LC50(典型抗生素废水的 体积百分比%)及其95%的置信限。 急性毒性测试结果为：青霉素废水96h LC50为13.46%(寇式法)和 13.66%(概率单位法);土霉素废水96h LC50为0.22%(寇式法)和0.19% (概率单位法);链霉素废水96h LC50为25.56%(寇式法)和29.51%(概 率单位法)。 (5)亚急性毒性测试方法参照步骤(4)的测试结果设置亚急性的暴 露组，暴露组浓度在1/6 96h LC50和1/2 96h LC50之间，设置5个暴露组， 青霉素废水、土霉素和链霉素暴露浓度组均为1/256 96h LC50、1/64 96h LC50、1/16 96h LC50、1/4 96h LC50、1/2 96h LC50。暴露组浓度以试验溶液 中含典型抗生素废水的体积百分比表示。每个暴露组设置2个平行组，1 个空白对照组，共计16个组。暴露时间为20天，选取健康的斑马鱼，雌 雄个体各半，每个组15尾斑马鱼，每天换水。5个暴露组分别于第4、8、 12、16和20天取生物样进行分析，每次各暴露组分别取2尾斑马鱼，测 定POD活性、SOD活性和MDA含量，测试结果为暴露组与空白对照组相 比，POD活性、SOD活性和MDA含量有显著差异; 所述试验溶液为典型抗生素废水和除氯自来水的混合溶液。 测试结果为对比暴露组与空白对照组的POD活性、SOD活性和MDA含量， 利用显著性t检验，检验暴露组与空白对照组间的差异，当t 本发明测试方法为，如果暴露组与空白对照组差异显著(0.01 本发明与现有技术相比具有的显著效果为： 本发明方法可以对典型抗生素废水的毒性特征和毒性水平进行分析测试和 定量描述，解决常规理化指标，如化学需氧量(COD)、生化需氧量(BOD)、 pH等不能反映的典型抗生素废水生物毒性，同时可以作为典型抗生素废水生物 毒性监测和评价的指标。