尽管很多人都看好硫酸盐还原厌氧氨氧化污水脱氮技术的前景，但对该反应也一直存在不同的看法。Wang等人在膨胀颗粒污泥床（EGSB）反应器中发现，随着进水NH4+-N浓度由166~666mg/L（N/S=0.25~0.99）增至1000~2000mg/L（N/S=1.48~2.96），硫酸盐去除率从64%提高至71%，同时还去除了71%的NH4+-N；然而，当提高NH4+-N浓度至3000mg/L（N/S>4.44）时，硫酸盐去除率却降至28%左右。杨世东等人在厌氧序批式反应器（ASBR）中发现，在保持硫酸盐为100mg/L条件下，当N/S值从1.0增加到3.0时，氨氮的平均去除率从78.5%增加到94.4%，但继续将N/S值提高至4.0时，氨氮的平均去除率却降至69.2%。可见，在不同N/S值条件下，硫酸盐还原厌氧氨氧化工艺对氨氮和硫酸盐的去除效率是不同的。
对于承担硫酸盐还原厌氧氨氧化的功能菌，Liu等在厌氧氨氧化反应器中分离出一种细菌，认为在硫酸盐还原厌氧氨氧化过程中Anammoxoglobussulfate细菌起着关键作用；Cai等人还分离出一株具有代谢氨氮和硫酸盐功能的细菌；另外，还有研究者认为硫酸盐还原厌氧氨氧化过程是多种细菌的代谢耦合共同完成的。而不管是Liu或Cai等人分离出的细菌，亦或是多种细菌代谢耦合，其均认为硫酸盐还原厌氧氨氧化过程属于微生物自养过程。对于自养过程而言，微生物除了摄取必需的含氮化合物和硫酸盐外，无机碳源的摄取也是必不可少的，且无机碳源的量也必定会对该过程有较大的影响。
由于去除机理不明，硫酸盐还原厌氧氨氧化工艺仍存在启动难度大、无法有效维持等诸多问题，这些问题严重阻碍了硫酸盐还原厌氧氨氧化工艺的推广及应用。故而，探明硫酸盐还原厌氧氨氧化工艺机理是当前的紧要问题。笔者通过改变一个成功启动的具有同步脱除氨氮和硫酸盐的上流式厌氧污泥床（UASB）反应器的进水N/S值与无机碳源浓度，分析了UASB反应器不同高度处发生的氮循环与硫循环，旨在探明UASB反应器中硫酸盐还原厌氧氨氧化工艺机理。
1、材料与方法
1.1 实验装置
实验装置如图1所示，采用有机玻璃制成的UASB反应器，反应器由反应区和三相分离区组成，内径为100mm，反应区高600mm，反应器的有效容积为4.71L，反应区外设置20mm厚的水浴保温层，在保温层外面包裹铝箔纸以避免光照影响微生物活性。实验期间，温度控制在（34±1）℃，pH控制在7.9±0.3，水力停留时间（HRT）设为24h。反应器各个接口处涂抹凡士林进行密封。
1.2 接种污泥与实验进水
实验用接种污泥取自西安市某啤酒厂的厌氧颗粒污泥，利用低浓度的NH4Cl与Na2SO（4NH4+-N与SO42--S分别为25、30mg/L）进行3个月的培养。初始MLSS为88.25g/L，MLVSS为47.32g/L，MLVSS/MLSS=0.54。
实验进水采用人工模拟废水，进水中的NH4+与SO42-分别由NH4Cl与Na2SO4提供。配水组分如下：27mg/L的KH2PO4、500mg/L的NaHCO3、500mg/L的KHCO3、38mg/L的CaCl2、20mg/L的MgCl2·6H2O，NH4Cl与Na2SO4按需添加，具体见表1。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 常规指标
常规指标的测试方法参考《水和废水监测分析方法》（第4版）。NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法测定；NO2--N、NO3--N及SO42--S均采用离子色谱法测定；S2-采用亚甲基蓝分光光度法测定；H2O2采用硫酸钛分光光度法测定；TOC采用TOC测定仪测定；pH采用PHS-3S型pH计测定；氧化还原电位（ORP）采用ORP仪测定；DO采用MO128-2M型便携式溶解氧仪测定；污泥中的微生物采用扫描电子显微镜（SEM）观察；元素分析采用场发射扫描电子显微镜（FESEM）进行。单质硫浓度根据以下公式进行计算：
1.3.2 批次实验方法及运行条件
氨氧化（AOB）活性测定：从反应器污泥底部取5mL泥水混合物，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次并离心（4000r/min），置于100mL的血清瓶中，加入NH4+-N浓度为50mg/L的模拟废水至100mL处，在34℃条件下曝气以提供饱和溶解氧，每隔2h取样一次，通过分析NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度的变化计算AOB活性。
厌氧氨氧化（AAOB）活性测定：从反应器污泥底部取5mL泥水混合物，用PBS冲洗3次并离心（4000r/min），置于100mL血清瓶中，加入NH4+-N和NO2--N浓度分别为50和70mg/L的模拟废水至100mL处，利用氩气对血清瓶进行除氧10min，将其密封后放入恒温振荡器（150r/min，34℃）进行反应，间隔6h取一次样，通过分析NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度的变化计算AAOB活性。
批次实验1：在COD分别为100、200、300mg/L条件下检测硫酸盐还原菌（SRB）活性，主要基质为Na2SO4和COD，其余基质与反应器进水相同，配制COD时均采用乙酸钠作为碳源。从反应器底部取5mL泥水混合物，用PBS冲洗3次并离心（4000r/min），置于100mL血清瓶中，加入130mg/L的SO42--S及不同浓度的COD，用氩气对血清瓶进行除氧10min，将其密封后放入恒温振荡器（150r/min，34℃）进行反应。分别在0、4、8、12与24h取样检测，通过分析SO42--S浓度的变化计算SRB活性。
批次实验2：检测反应器中的硫自养反硝化（SAD）现象，主要基质为硫粉及NO2--N和NO3--N。从反应器底部取5mL泥水混合物，用PBS冲洗3次并离心（4000r/min），置于100mL血清瓶中，加入32mg/L硫粉以及14mg/L的NO2--N及NO3--N，利用氩气对血清瓶进行除氧10min，将其密封后放入恒温振荡器（150r/min，34℃）进行反应。分别在0、4、8、16与24h取样检测，通过分析SO42--S以及NO3--N浓度的变化计算SAD活性。
为提高实验的准确性，批次实验均设置3组平行样，采用注射氩气进血清瓶以保证瓶内的厌氧环境，每次取样体积保持相同。所取样品经0.22μm的滤头过滤后再测定相应指标。
1.3.3 微生物菌群分析
污泥微生物群落结构分析采用基于IlluminaMiSeq测序平台的细菌16SrDNA高通量测序技术。测序流程包括以OMEGA试剂盒E.Z.N.A™MagBindSoilDNAKit提取试剂盒进行微生物总DNA提取、聚合酶链式反应扩增、扩增产物回收纯化、扩增产物荧光定量、MiSeq文库构建和MiSeq测序。其中，PCR扩增采用的引物为MiSeq测序平台的16SV3-V4通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTA ATCC-3′）。以上工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
2、结果与分析
2.1 不同N/S值下NH4+-N与SO42--S的脱除效果
UASB反应器中NH4+-N、SO42--S、pH及S2-浓度的变化如图2所示。在阶段Ⅰ，N/S值保持在1.54，NH4+-N的平均脱除量为3.66mg/L，SO42--S的平均脱除量达到6.64mg/L，运行初期即观察到NH4+-N和SO42--S发生了脱除现象。在阶段Ⅱ提高SO42--S浓度后，N/S值达到了0.95，与阶段Ⅰ相比，NH4+-N脱除量明显增加，由3.66mg/L提高至11.02mg/L，SO42--S脱除量则略微降低，平均为5.44mg/L。
在阶段Ⅲ和Ⅳ，提高NH4+-N浓度，进一步提高N/S值后，NH4+-N平均脱除量由11.02mg/L提高至23.86mg/L，而SO42--S平均脱除量则逐渐降至2.53mg/L。在阶段Ⅴ，降低SO42--S浓度，避免反应器中S2-进一步积累，此时NH4+-N平均脱除量达到26mg/L，而SO42--S平均脱除量进一步降至1.25mg/L。提高NH4+-N浓度至100mg/L后进入阶段Ⅵ，NH4+-N脱除量逐渐升高，平均脱除量达到了26.78mg/L，而SO42--S在运行末期基本不发生转化。
接种污泥经过3个月的驯化，在经过短暂适应期后NH4+-N与SO42--S均发生脱除现象，出现硫酸盐型厌氧氨氧化现象。从图2可以看出，当调整进水N/S值时，NH4+-N与SO42--S脱除量并未受到明显影响。在反应器运行期间，NH4+-N脱除量呈缓慢上升的趋势，而SO42--S的脱除量波动较大且呈不断下降趋势。在实验后期检测不到SO42--S的脱除，可能是由于污泥衰亡产生SO42-以及发生的硫自养反硝化反应，形成了硫的再循环。反应器前期出水S2-浓度较高、波动较大，之后S2-浓度逐渐稳定在1.45mg/L左右。由于在反应器中未检测到其他含硫物质，通过物料衡算得出至少存在35.06mg/L含硫物质积累于反应器中。
实验初期即观察到NH4+-N和SO42--S发生了脱除现象，但这一现象并不稳定。NH4+-N脱除量逐渐升高，SO42--S脱除量却逐渐降低。进水中存在的饱和溶解氧仅为8mg/L，按照硝化反应来计算不足以氧化等量的NH4+-N，但是NH4+-N仍有较高的脱除量，Zhang等人认为HCO3-有可能作为电子受体参与了N和S之间的反应，因此本研究考察了不同浓度的HCO3-对NH4+-N和SO42--S转化的影响。
2.2 HCO3-对NH4+-N和SO42--S转化的影响
本实验中添加NaHCO3以及KHCO3作为无机碳源维持反应器pH稳定，在连续流反应器持续运行至第162天时，NH4+-N、SO42--S及HCO3-浓度保持在100、60、305mg/L。如图3所示，分别在第187天、第209天和第237天提高HCO3-浓度至668、835、1002mg/L，发现NH4+-N脱除量逐渐上升，SO42-脱除量则未受到影响，在本实验中HCO3-并未参与到N和S的反应中。而反应器在第89天时通过批次实验也检测到3.4mgNH4+-N/gVSS的Anammox活性，即存在少量的Anammox菌。Anammox菌可通过厌氧氨氧化途径将氨氮转化后的少量NO2-作为电子受体，将氨氮氧化为N2，进一步提高氨氮的脱除量。
当HCO3-浓度提升至1002mg/L时，NH4+-N转化量趋于稳定。分析原因，一方面可能是反应器底部的Anammox菌较少，利用HCO3-的能力已达到饱和；另一方面可能是前期能够利用HCO3-的兼性自养微生物较少，导致HCO3-不能得到有效利用。对在反应器底部发现的黄色物质进行XRD检测，发现在转角为29.3°、35.9°、39.4°与43.1°处均有吸收峰，表明该物质主要为CaCO3。HCO3-大量积聚在反应器中，与进水中的Ca2+、Mg2+生成CaCO3及MgCO3等沉淀附着于颗粒污泥表面，不仅影响传质效率，还会加速颗粒污泥解体，进而影响出水水质。
此外，由于UASB反应器的特点，在长期运行过程中污泥层菌群在反应器内呈垂直分布，可能出现各污泥层生化反应相耦合，导致NH4+-N及SO42--S的脱除，而在本实验中NH4+-N与SO42--S的变化趋势也表明有其他电子受体及其他生化反应参与了NH4+-N和SO42--S的转化，因此检测不同高度出水水质，以探究可能的转化途径。
2.3 不同高度处NH4+-N与SO42-的转化情况
同一时刻在不同高度处采集水样进行检测，结果如图4所示。进水NH4+-N在反应器底部即被脱除，由100.34mg/L降至73.23mg/L。此外，部分厌氧颗粒污泥上浮裂解，细菌死亡，导致出水口处的NH4+-N浓度上升，这也与体系内检测到的ORP及TOC浓度变化一致。
TOC及SO42--S浓度呈先上升后下降的趋势，SO42--S浓度先由135.16mg/L逐渐升至170.16mg/L，然后逐渐下降，在出水口处达到最低浓度135.08mg/L，由此观察到出水SO42--S未能脱除。在中部污泥层TOC浓度高达20.12mg/L，SRB菌利用大量有机物及SO42--S进行异养硫酸盐还原产生S2-，S2-浓度最高可达13.61mg/L。
由于进水中含有少量溶解氧，反应器底部发生了硝化作用使得NH4+-N浓度降低，而底部厌氧污泥死亡使TOC及SO42--S浓度逐渐升高。同时，厌氧污泥死亡时会释放H2O2及·OH等氧化性物质而氧化NH4+-N，导致NH4+-N在厌氧污泥层被脱除。硫自养反硝化反应与硝化反应相耦合，S0或S2-被重新氧化为SO42--S，在反应器中上层SRB菌利用SO42--S及TOC发生硫酸盐还原反应。综上所述，认为实验期间NH4+-N与SO42--S在不同位置分别被脱除。
2.4 反应器中N与S共同参与的反应
反应器底部NH4+-N由于硝化作用被氧化为NOx--N的同时，还存在硫酸盐还原的产物S2-及S0。在S0及NOx--N都存在的情况下，硫自养反硝化细菌逐渐被富集而发生反应，反应方程式如下：
批次实验2中分别添加S0以及NO2--N和NO3--N来证明反应器内发生的硫自养反硝化反应，对照组中仅放入与实验组等量未添加任何基质的污泥，空白组仅添加基质溶液，实验结果如图5所示。、
在厌氧条件下对照组中的微好氧菌死亡导致SO42--S浓度升高，实验组中NO2--N和NO3--N浓度下降，SO42--S浓度不断上升且远远高于对照组，说明反应器中可发生硫自养反硝化反应，而S0的再氧化很可能是后期SO42--S不发生脱除的原因之一。因此认为，污泥中的微生物可利用NOx--N与S0实现N元素与S元素在反应器中的协同循环。
2.5 反应器中的硫酸盐还原反应及其产物
运行初期SO42--S脱除量较高，之后逐渐降低，到后期SO42--S甚至不发生脱除。接种污泥浓度较高，MLVSS可达47.32g/L，在运行期间不断衰亡释放有机物。随着反应器的不断运行，污泥衰亡量逐渐降低，其释放的TOC浓度呈下降趋势，而SRB极有可能利用污泥衰亡释放的TOC进行异养硫酸盐还原，因此在厌氧环境下利用不同COD浓度进行批次实验以检测硫酸盐还原活性。
批次实验1中SO42--S浓度及ORP变化见图6。
由图6可知，1h内SO42--S浓度均有不同程度的上升，原因可能是污泥中含有的微好氧菌死亡释放了部分SO42--S及有机物，而ORP则由于微生物死亡释放有机物而短暂下降。之后SRB菌利用有机物进行异养硫酸盐还原产生S2-，SO42--S浓度不断降低，ORP在COD被消耗后缓慢回升。在COD为300mg/L的条件下，测得硫酸盐还原活性最高，为9.91mgSO42--S/（gVSS·d）。
同时对反应器上层发现的部分黄色物质进行XRD检测，发现在转角为23.1°、25.9°、26.7°、27.7°及28.7°处均有吸收峰，显示有S0生成。由于S2-为耗氧型污染物，易被氧化物质氧化，而反应器上层由于漏氧、水封条件差或颗粒污泥上浮裂解释放氧化物质等因素，使得S2-逐渐被氧化为S0。
自来水以及污泥中所含Fe、Cu等金属元素容易与SRB还原生成的S2-结合生成含硫矿物，形成以金属或非金属物质作为晶核的沉淀，为此对底部黄色污泥进行SEM观察（如图7所示），同时对反应器底部及中部初期和后期污泥进行元素分析，结果见表2。从图7和表2可以看出，污泥中存在含硫沉淀形成的结晶物，且由于反应器内形成了CaCO3沉淀，反应器底部与中部污泥的Ca元素占比均明显提高。与初期相比，后期反应器底部污泥中的S元素占比较低，可能是由于发生硫自养反硝化导致S0重新生成了SO42--S。中部污泥的S元素则开始积累，S元素占比由初始的1.1%积累至2.3%，说明发生硫酸盐还原反应生成了S2-，之后被氧化为S单质积累在污泥层中，这也与2.3节的结果一致。
2.6 反应器中的氮和硫循环
反应器底部污泥负责NH4+-N的转化。一方面，实验初期接种的厌氧颗粒污泥中混有少量有机物，经过厌氧发酵后产生多种代谢产物，使异养菌大量增值同化NH4+-N，导致在厌氧环境下NH4+-N浓度降低；另一方面，由于进水桶未进行除氧，进水中携带少量的溶解氧（约8mg/L），当反应器底部兼性厌氧菌受到O2刺激时会产生H2O2，在反应器底部、中部及上部测得H2O2浓度分别为1.4、2.3、3.1mg/L，H2O2可氧化NH4+-N，提高NH4+-N的脱除量。而反应器内SO42--S的转化则主要利用体系内污泥死亡释放的TOC进行SO42--S还原。
当运行至第89天时，底部污泥逐渐由黑色转变为黄色，经批次实验证明底部污泥的硝化能力可达到30.25mgNH4+-N/（gVSS·d），且高通量测序同样表明，底部污泥中存在硝化菌。硝化菌利用少量溶解氧将NH4+-N转化为NO2--N，不仅为Anammox菌生长提供了所需的NO2--N，而且为Anammox菌增殖创造了条件。由于反硝化菌初始丰度比Anammox菌要高，对NO2--N的竞争力较强，初期Anammox菌的丰度较低，没有合适的底物可供利用，生长较为缓慢，导致NH4+-N脱除量较低。反应器经过长时间运行后，硝化活性逐渐增强，硝化菌以及H2O2等使得NH4+-N脱除量提高，提供更多的NO2--N从而促进Anammox菌的生长。第89天利用批次实验检测到反应器底部的Anammox活性为3.4mgNH4+-N/（gVSS·d），Anammox反应参与底部NH4+-N的转化，进一步提高了NH4+-N的脱除量。
在反应器运行至第150天时，SO42--S不发生脱除则是由于进水溶解氧使得厌氧污泥死亡，释放了额外的SO42--S。此外，由于污泥携带的有机物被消耗，SRB仅利用污泥衰亡产生的TOC进行SO42--S还原，SO42--S还原量逐渐减少。同时，在反应器底部发生的硫自养反硝化反应以及中部的硫氧化反应，也使得S2-或S0重新生成SO42--S，最终使得出水SO42--S基本不发生转化。
因此推断，在反应器下层发生的是Anammox、硝化及硫自养反硝化耦合的生化反应，在中层与上层则发生的是硫酸盐还原及硫氧化反应，见图8。
2.7 微生物菌群解析
利用高通量技术分析了反应器在0、89、240d时污泥的微生物菌群结构，结果见图9。可知，在反应器的3个运行阶段，硝化菌、反硝化菌、硫酸盐还原菌、硫自养反硝化菌以及硫氧化菌均存在。
在反应器底部检测到Acinetobacter，其丰度由初始的0.023%增至第240天的25.22%，同时检测到Comamonadaceae、Pseudoxanthomonas、Thiobacillus、Thermomonas等反硝化菌，初始总丰度仅为0.5%，在第89天提高至6.51%。其中，Thiobacillus是一种硫自养反硝化菌，其丰度由初始的0逐渐提高至1.32%，说明反应器中确实存在硫自养反硝化反应，这与2.5节的结果相吻合。高通量测序中并未发现Anammox菌，但在反应器运行至第89天时利用批次实验检测到较低的Anammox活性。反应器中Desulfomonile、Desulfovibrio及Syntrophobacteraceae等SRB菌，在初始接种污泥中的总丰度可达到4.96%，随着反应器内有机物的减少，SRB菌的总丰度呈下降趋势，在第240天下降至1.67%，这也与反应器中硫酸盐脱除量降低的趋势相吻合。同时，在反应器中存在少量的硫氧化菌属，例如Rhodopseudomonas、Rhodobacteraceae等，可利用H2S进行代谢自养生长，总丰度可达到0.188%。
在第162天提高HCO3-浓度以后，NH4+-N脱除量增加。在主要负责脱氮的底部污泥中，检测到Acinetobacter菌的丰度提高至78.87%。有研究者发现，Acinetobacter菌具有硝化及反硝化能力，甚至部分Acinetobacter菌群可进行异养硝化脱氮。底部污泥衰亡产生的少量有机物为Acinetobacter菌群异养硝化提供了基质，同时进水中少量的DO以及H2O2为Acinetobacter的好氧反硝化提供了条件，导致其大量增殖，反应器中氨氮的脱除主要发生在底部污泥中，而其与混合污泥菌群的差别仅在于Acinetobacter的丰度。即Acinetobacter的丰度决定了反应器的脱氮效果，因此认为Acinetobacter在反应器中起主要的脱氮作用。Desulfomonile、Desulfovibrio及Syntrophobacteraceae则是反应器中主要的SRB菌，利用SO42-作为电子受体进行SO42-还原反应。Thiobacillus作为反应中的硫自养反硝化细菌，可将SO42-还原生成的S2-或S0以NOx--N为电子受体氧化为SO42-，与硫氧化菌共同形成硫的再循环，其丰度逐渐提高使得SO42-的脱除量进一步降低，这也与2.1节中的推测相吻合。在本实验中并未发现Cai等人鉴定出的可以同时利用NH4+-N以及SO42--S的BacillusBenzoevorans菌株，也未曾发现Liu等人在Anammox反应器中分离得到的脱氮除硫功能菌种Anammoxoglobussulfate。
因此，在本研究的反应器中，硝化、Anammox、异养反硝化及硫自养反硝化共同构成了系统内的氮循环；硫酸盐还原、硫自养反硝化及硫好氧氧化共同构成了系统内的硫循环，氮、硫循环耦合使得反应器中出现硫酸盐还原厌氧氨氧化。
3、结论
①改变UASB反应器进水N/S值时，NH4+-N与SO42--S的脱除量并未受到明显影响。体系内存在的Anammox反应、兼性厌氧微生物产生的H2O2以及提高HCO3-浓度均有助于NH4+-N脱除量的提高。在将HCO3-浓度提高至1002mg/L后，NH4+-N脱除量不再升高。
②由于UASB反应器的特点，在不同高度污泥层形成了不同种类的微生物菌群，NH4+-N和SO42--S在不同位置分别被脱除，由不同层的氮、硫生化反应相互耦合形成硫酸盐型厌氧氨氧化现象。
③溶解氧使得厌氧污泥死亡产生额外的SO42--S，SO42--S还原生成的S2-被Rhodopseudomonas、Rhodobacteraceae等硫氧化菌以及硫自养反硝化菌重新氧化为SO42--S，在反应器内部形成硫循环，导致出水SO42--S不发生脱除。而Acinetobacter主要负责反应器内NH4+-N的脱除，与Anammox、异养反硝化及硫自养反硝化共同构成体系内的氮循环。（来源：西安建筑科技大学环境与市政工程学院，陕西省环境工程重点实验室，西北水资源与环境生态教育部重点实验室）