随着水体富营养化问题日益突出，氮素污染的防治越来越受到人们的重视。目前污水脱氮处理方法主要有化学法、生化法及生物物理-物化组合工艺。其中生物脱氮以其经济、高效、无残留污染的优点，成为污水脱氮的主要手段。但是，传统的生物脱氮分硝化和反硝化等不同过程，要求在2个反应器中进行，故建设成本高，而且反硝化部分还需要投加大量碳源。
近年来，随着具有异养硝化-好氧反硝化特性菌株的发现，利用异养硝化-好氧反硝化菌研发污水脱氮技术已成为研究热点。与传统硝化微生物相比，异养硝化-好氧反硝化菌具有更高的细胞生长速率，并且实现了在同一个反应器中同步完成硝化和反硝化反应，同时将氨氮、硝态氮和亚硝态氮转化为含氮气体。而且，在硝化和反硝化过程中分别产生的酸和碱能相互中和，从而相对维持水体酸碱平衡，减少pH调节成本。此外，一些特殊异养硝化-好氧反硝化菌甚至还具备耐受高氨氮、高盐度、低温和低C/N的特性。目前已发现的异养硝化-好氧反硝化菌主要有产碱菌属(Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)等。然而，由于异养硝化-好氧反硝化菌在养殖废水中存在脱氮效果稳定性差、环境适应力和竞争力弱等问题，故实际应用于畜禽养殖废水的异养硝化-好氧反硝化菌较少。为此，本研究从南昌县一中型养猪厂曝气池筛选出一株脱氮性能较好的异养硝化-好氧反硝化菌株YZ-12，经过16SrRNA基因序列分析鉴定菌株种属，分析了优化菌株脱氮条件，并将该菌株应用于养猪废水脱氮实验，以期为猪场养殖废水提供脱氮效果优良、环境适应力和竞争力强的微生物菌剂。
1、材料与方法
1.1 实验材料
筛选样品采自南昌县一中型养猪厂曝气池；细菌DNA提取试剂盒购自美国OmegaBio-Tek公司，PCR聚合酶购自TOYOBO公司，27F/1492R引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 培养基
富集培养基的成分为：1g胰蛋白胨，0.5g酵母膏，0.1gKNO3，1L蒸馏水，pH为7.2。BTB初筛培养基：8.5gC4H4Na2O4∙6H2O，1gKNO3，1gMgSO4∙7H2O，1gKH2PO4，0.05gFeSO4∙7H2O，0.2gCaCl2∙2H2O，20g琼脂，1mL1%溴百里酚蓝，1L蒸馏水，pH为7.0~7.3。硝化培养基的成分为：11gC4H4Na2O4∙6H2O，6.7gNa2HPO4∙12H2O，1.5gNH4Cl，1gKH2PO4，0.1gMgSO4∙7H2O，2mL微量元素溶液，1L蒸馏水，pH为7.0~7.3。反硝化培养基的成分为：13gC4H4Na2O4∙6H2O，7.9gNa2HPO4∙12H2O，3gKNO3，1.5gKH2PO4，0.1gMgSO4∙7H2O，2mL微量元素溶液，1L蒸馏水，pH为7.0~7.3。微量元素溶液的成分为：50gEDTA，7.28gCaCl2∙2H2O，5gFeSO4∙7H2O，3.92gZnSO4∙7H2O，2.06gMnCl2∙4H2O，1.61gCoCl2∙6H2O，1.57gCuSO4∙5H2O，1.1g(NH4)6Mo7O24∙4H2O，1L蒸馏水，pH为6.0。
1.3 异养硝化-好氧反硝化菌的筛选及鉴定
取10mL养殖废水，加入到装有90mL无菌富集培养基的250mL三角瓶中，30℃、120r∙min-1恒温培养24h，取5mL培养液转接，重复富集3次。将富集液进行梯度稀释(10-4~10-7)，取0.2mL涂布于BTB初筛培养基上，在30℃培养箱中培养至出现明显的单菌落。挑取变蓝单菌落，经多次划线纯化后于4℃冰箱中保存。
将保存的菌株分别接种于无菌富集培养基中，在30℃、120r∙min-1下恒温培养24h，按3%接种量分别加到硝化培养基和反硝化培养基中，在30℃、120r∙min-1下恒温培养48h，取培养液检测NH4+-N、NO3--N、NO2--N浓度，从而筛选出具有较好脱氮性能的异养硝化-好氧反硝化菌。
采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株基因组的样品，利用27F/1492R引物对样品DNA进行扩增，用Sanger法对PCR产物进行测序，采用双向引物测序，测序结果采用DNAMAN软件进行拼接处理。
1.4 菌株的脱氮性能研究
1)菌株生长曲线的测定。菌株于富集培养基中活化后，按3%接种量分别接种于硝化培养基和反硝化培养基中，在30℃、120r∙min-1下恒温培养54h，每3h检测培养液OD600值，每6h检测NH4+-N、NO3--N、NO2--N的质量浓度。
2)菌株的脱氮条件优化实验。考察了碳源、氮浓度、C/N、pH、盐度5种单因素对菌株脱氮效果的影响。其中，碳源分别为葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、甲醇和丁二酸钠；NH4+-N质量浓度分别为50、100、150、200和250mg·L-1；NO3--N质量浓度分别为400、450、500、550和600mg·L-1；C/N分别为2.5、5、10、15和20；pH分别为5、6、7、8和9；盐度分别为10、20、30、40和50g·L-1。30℃、120r∙min-1恒温培养72h，每24h取样检测培养液OD600值及NH4+-N、NO3--N、NO2--N质量浓度。
1.5 菌株在养殖废水中的应用
供试样品为曝气池的水泡粪污水，采集自南昌县一中型养猪厂污水处理站好氧池。经检测，养殖废水样品中COD为2031mg·L-1，NH4+-N质量浓度为362mg·L-1，NO3--N质量浓度为23.8mg·L-1，pH为7.8。
用蔗糖将养殖废水C/N调节为10，并进行以下3种处理：1)121℃灭菌30min，按5%接种量接入菌株YZ-12悬液；2)不灭菌，按5%接种量接入菌株YZ-12悬液；3)不灭菌，按5%接种量接入无菌水。在30℃，120r∙min-1恒温培养48h，每24h取样检测NH4+-N、NO3--N、NO2--N质量浓度，每个处理3个重复。
1.6 分析方法
NH4+-N使用纳氏试剂分光光度法测定；NO3--N、NO2--N使用离子色谱法测定；OD600使用光电比浊法测定；COD使用重铬酸盐法测定；pH使用上海雷磁PHSJ-3FpH计测定。
2、结果与讨论
2.1 异养硝化-好氧反硝化菌的筛选及鉴定
从养殖废水中共筛选出15株细菌，脱氮效果如图1所示。其中12号菌株(YZ-12)对氨氮去除率为60.52%，对硝态氮去除率为93.39%，其脱氮效果最佳，故将其用于后续的脱氮实验。
提取菌株YZ-12的DNA，使用细菌16S通用引物进行扩增测序，将测序结果得到的seq文件中的序列信息，输入NCBI数据中的Blast比对系统中，搜索数据库中相似的序列，得到序列比对结果。菌株YZ-12与Klebsiellaoxytoca strain相似度最高，同源性为100%，采用Mega7.0软件构建菌株系统发育树(图2)。
2.2 菌株YZ-12的脱氮性能研究
1)菌株YZ-12生长曲线的测定。由图3可以看出，菌株YZ-12的对数生长期为12~30h，稳定期为30~48h，48h后进入衰亡期。在对数生长期，氨氮被快速去除，NH4+-N由326mg·L-1下降至156mg·L-1，氨氮去除率为52.15%。在此脱氨过程中，硝态氮有少量产生后又去除，亚硝态氮几乎未检出，这与AN等、陈猛等的研究结果类似。由于初始氨氮质量浓度较高，与邹艳艳等的研究结果相比，氨氮去除率下降明显，但氨氮去除量明显增加。在0~24h，NO3--N由415mg·L-1下降至0.215mg·L-1，硝态氮去除率为99.95%，同时NO2--N不断积累，最高达到356mg·L-1。这与杨静丹等的研究结果类似，碳源和碳氮比可能对NO2--N积累均有影响。
2)碳源对菌株YZ-12脱氮效果的影响。异养硝化-好氧反硝化是氧化还原反应，不同的碳源具有不同的氧化还原电位，所以会产生不同的脱氮效果。由图4可以看出，以葡萄糖、蔗糖、丁二酸钠为碳源进行异养硝化时，菌株均能正常生长，OD600值达到1.9以上，氨氮去除率最大分别为30%、42.86%、42.57%。此时，菌株无法利用甲醇为碳源，几乎不生长，以乙酸钠为碳源进行异养硝化时，菌株生长也受到抑制。因此，与甲醇、乙酸钠、葡萄糖等碳源相比，蔗糖、丁二酸钠作为异养硝化的碳源更具优势。
由图5可知，以葡萄糖、蔗糖、丁二酸钠、乙酸钠为碳源进行好氧反硝化时，菌株能正常生长，72h时NO3--N去除率均达到99%。其中，以葡萄糖、蔗糖为碳源时，24h时NO3--N去除率达到99%。但以葡萄糖、丁二酸钠、乙酸钠为碳源时，NO2--N有明显累积，而以蔗糖为碳源时NO2--N几乎未检出。综合选择，蔗糖作为好氧反硝化碳源更具优势。这与LIU等的研究结果一致。
3)初始氨氮质量浓度对菌株YZ-12脱氮效果的影响。不同废水含氮量不同，配置不同初始氮浓度培养液，研究菌株的脱氮效果。由图6可以看出，菌株YZ-12的异养硝化主要在24~48h，这是菌株生长期和稳定期，这24h内平均NH4+-N去除速率分别为1.10、2.86、3.90、4.06、4.17mg·(L·h)-1。当初始氨氮质量浓度为150~250mg·L-1时，其NH4+-N去除速率趋于稳定；当初始氨氮质量浓度为50mg·L-1时，菌株YZ-12因为氮源不足，影响菌的生长，从而影响了NH4+-N去除速率。高游离氨浓度废水对异养硝化-好氧反硝化菌具有毒性，当NH4+-N为150、200、250mg·L-1时，其氨氮去除率分别为86.64%、67.02%、53.81%，与NH4+-N为100mg·L-1时96.81%的去除率相比，差异显著。
硝态氮质量浓度对YZ-12好氧反硝化的影响如图7所示。菌株YZ-12的好氧反硝化主要发生在0~48h，当初始硝态氮质量浓度为400~450mg·L-1时，在0~24h的NO3--N去除速率分别为16.56、16.43mg·(L·h)-1；当初始硝态氮质量浓度升高至500~600mg·L-1时，在0~24h的NO3--N去除速率分别下降至8.96、6.50、4.71mg·(L·h)-1，同时还有部分亚硝态氮积累。这可能因高浓度硝态氮对菌株的好氧反硝化作用起到了抑制作用。
4)碳氮比对菌株YZ-12脱氮效果的影响。不同碳氮比对菌株YZ-12脱氮的影响如图8和图9所示。在C/N为2.5和5的硝化培养液中，菌株生长缓慢，NH4+-N去除率不高，分别为40.00%和62.84%。这是因为低C/N影响微生物酶活性，从而影响脱氮率及菌株的生长。当C/N为10、15、20时，NH4+-N均在48h后降至10mg·L-1以下，菌株生长良好。所以，菌株YZ-12异养硝化最佳C/N为10~20。
对于菌株好氧反硝化而言，当C/N在2.5~20时，菌株均能良好生长，且C/N越高，菌株生长越好。当C/N为5~20时，培养24h后其NO3--N去除率为99.6%。在C/N=10时，NO2--N有明显累积，后又去除；但当C/N=5时，NO3--N均转化为NO2-N；当C/N=2.5时，NO3--N也慢慢转化为NO2--N，未能去除。综合考虑，菌株YZ-12最佳好养反硝化C/N为10~20。这符合大多数异养硝化-好氧反硝化菌最佳C/N范围(6~20)。
5)pH对菌株YZ-12脱氮效果的影响。不同pH对菌株YZ-12脱氮的影响如图10和图11所示。在pH为5~9的硝化培养液中，菌株均能正常生长。菌株在pH为7、8、9的培养液中培养48h，NH4+-N去除率均为98%以上。但在酸性条件下NH4+-N去除率有所下降，在pH为5和6时，NH4+-N最大去除率分别为62.00%和78.53%。这说明菌株YZ-12更适合处理中性及偏碱性废水，这与胡杰等获得的结果相近。
酸性环境不仅影响菌株YZ-12降解硝态氮效果，同时还会影响菌株生长。菌株在pH为7、8、9的培养液中培养24h，NO3--N的去除率均在99%以上，且生长良好；但pH为7时，则有62.7mg·L-1的NO2--N积累。有研究表明，反硝化酶在中性或微碱性环境中活性更高，在偏酸性条件下其活性受到抑制，导致脱氮效果下降，这与本研究结果一致。
6)盐度对菌株YZ-12脱氮效果的影响。部分异养硝化-好氧反硝化菌具有耐盐性。由图12可以看出，盐度对硝化作用影响显著，在盐度为10g·L-1和20g·L-1的异养硝化培养基中，菌株YZ-12能够正常生长，NH4+-N去除率最大分别为99.02%和66.70%；当盐度为30g·L-1时，菌株在48h适应高盐环境后开始生长，NH4+-N在72h时去除率为23%。这说明菌株具有一定的耐盐性。当盐度≥40g·L-1时，高盐环境会破坏细菌细胞，抑制细菌生长及代谢过程，导致菌株无法大量繁殖。
盐度对YZ-12好氧反硝化的影响如图13所示。当盐度≥40g·L-1时，菌株也无法在反硝化培养基中生长；盐度≤30g·L-1时，菌株具有良好的反硝化能力，培养48h后，NO3--N去除率均达到99%，同时仅有部分亚硝态氮积累。这说明菌株YZ-12属于耐盐菌，具有处理高盐硝态氮废水的能力。
2.3 菌株YZ-12在养殖废水中的脱氮效果
由图14可以看出，不同的处理方式下脱氮效果亦不同。不加菌液的养殖废水中的微生物在合适的C/N条件下，NH4+-N和NO3--N的去除率分别为71.82%和55.46%。这说明养殖废水中本身存在脱氮菌，在适宜生长条件下可以起到部分脱氮作用。不灭菌加5%菌液处理的养殖废水NH4+-N和NO3--N的去除率分别为88.54%和96.0%。这说明加入5%的YZ-12菌液后，YZ-12在养殖废水中竞争力强，能够提升脱氮效果，但受到其他菌种的影响。灭菌加5%菌液处理的养殖废水NH4+-N和NO3--N的去除率分别为95.15%和99.69%。该处理的NH4+-N去除率高于陈猛等实验结果，与陈均利等的实验结果相似，说明菌株YZ-12在不受其它菌株影响时，对养殖废水具有更好的脱氮效果。
3、 结论
1)从养猪厂污水处理站曝气池筛选出一株异养硝化-好氧反硝化菌株Klebsiellaoxytoca YZ-12，该菌株具有较好的异养硝化-好氧反硝化能力，同时还具有一定的耐盐性，能够独立完成脱氮全部过程。
2)菌株YZ-12最适脱氮条件为C/N=10、pH=7、盐度≤10g·L-1、NH4+-N质量浓度≤150mg·L-1、NO3--N质量浓度≤450mg·L-1、碳源为蔗糖。
3)调节养殖废水C/N后加入5%YZ-12菌株对其进行脱氮处理，48h后NH4+-N去除率达95.15%，NO3--N去除率达99.69%。这说明该菌株脱氮性能好且在养殖废水中具有较强的竞争力和适应力。（来源：江西中江环保集团股份有限公司，赣江新区高浓度有机废水污染控制工程技术研究中心）