申请日2011.03.17
公开(公告)日2012.09.19
IPC分类号G01N21/35
摘要
本发明涉及一种活性污泥海藻糖含量的测定方法，属于环境工程学科中的污水生物处理技术领域。为了实现海藻糖在污水生物处理技术领域内的应用，本发明以蒽酮比色法为基础，对活性污泥微生物细胞内的海藻糖进行三氯乙酸-超声联合提取，海藻糖遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，在610nm处比色测定活性污泥中海藻糖的含量。本发明的积极效果是该法安全可靠、简单易行，成本较低，测定精度高，可实现活性污泥中海藻糖的准确快速测定。
权利要求书 [支持框选翻译]
1.本发明的使用特征是：活性污泥海藻糖含量的测定过程中，取0.8mL的活性污泥混合液置于离心机中离心，用蒸馏水冲洗、搅拌离心所得活性污泥再离心，去掉上清液后加入三氯乙酸溶液，通过超声处理后离心，取其上清液加入蒽酮试剂，冷却后置于沸水浴中6min，再冷却，用1cm比色皿在610nm波长下测定吸光度，最后根据吸光度和污泥称重结果计算活性污泥细胞内海藻糖含量。
说明书 [支持框选翻译]
一种活性污泥海藻糖含量的测定方法
技术领域
本发明属于环境工程学科中的污水生物处理技术领域，具体涉及一种活性污泥海藻糖含量的测定方法。
背景技术
海藻糖(Trehalose)是一种非还原性二糖，由2个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键连接而成，分子式为C12H22O11·2H2O，相对分子量为378.33，白色结晶，化学性质极其稳定，无毒无害，不会焦糖化。研究表明，海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是生物体应对外界环境刺激的一种重要代谢产物。生物体在恶劣环境下表现出的抗逆耐受力与它们体内存在的海藻糖含量密切相关，生物体可以通过调节合成体内海藻糖来抵御外界伤害。目前，生物体海藻糖分析测定技术已广泛应用于食品、医药、化妆品等产业领域，但在环境工程领域内至今没有得到应用。
由于在实际运行的污水生物处理系统中活性污泥时刻承受着因负荷变化、环境温度变化、pH值变化等带来的冲击，这种冲击也会反映在污水生物处理工艺中活性污泥的海藻糖含量水平上，因此通过分析测定活性污泥微生物细胞内海藻糖含量，可以准确地表征出活性污泥受到外界环境刺激的程度，并可寻找利用外援海藻糖强化活性污泥应激能力的技术方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，由于目前在污水生物处理领域尚没有测定活性污泥海藻糖的技术方法，无法研究分析海藻糖与活性污泥之间的内在关系，因此本发明设计了活性污泥中海藻糖的测定方法，以实现海藻糖在环境工程领域内的应用。
该方法的原理是采用蒽酮比色法为基础，对活性污泥微生物细胞内的海藻糖进行三氯乙酸-超声联合提取，海藻糖遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，使该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于610nm处有最大吸收，在此处可比色测定活性污泥中海藻糖的含量。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术步骤进行：
向10mL离心管中加入0.8mL的活性污泥混合液置于离心机中，在4500r/min下离心5min;用蒸馏水冲洗、搅拌离心所得活性污泥，在4500r/min下离心5min，反复3次;去掉离心上清液后加入6mL、0.4mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液，将其置于超声破碎机中超声处理80min，然后在4500r/min下离心8min，上清液即为海藻糖提取液;取蒽酮试剂10mL加入到50mL发酵管中，加入前述离心过程中所得海藻糖提取液5mL，并迅速浸入冷水浴中冷却，然后置于沸水浴中6min，取出后迅速冷却至室温，用1cm比色皿在610nm波长下测定吸光度;同时将前述经超声离心处理过程中产生的污泥在(105±1)℃下烘干1h后称重;最后根据吸光度和污泥称重结果计算活性污泥细胞内海藻糖含量。
活性污泥细胞内海藻糖含量的计算公式为：
C——混合液中每毫克活性污泥中海藻糖的含量(mgL-1/mgMLSS);
K——标准曲线斜率;
W——污泥净重(mg);
D610——波长610nm处海藻糖与蒽酮试剂显色溶液的吸光度。
本发明的积极效果是：
1、该方法安全可靠、简单易行，可实现活性污泥中海藻糖的快速测定;
2、该方法所用仪器设备均为实验室常规仪器，无需大型检测设备，具有价廉易实现的特点，分析成本较低;
3、该方法大幅度地降低了因污泥含量变化所导致的误差，提高了测定计算精度，其测定结果与国家标准样品进行正交比对，数据回归率达99.5%。
具体实施方式
1、标准曲线绘制
将0.1g海藻糖标准品溶于水，定容到100mL配置成标准溶液。准确吸取标准海藻糖溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，置于100mL容量瓶中，定容，摇匀(分别相当于0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0mg/L海藻糖溶液)。取蒽酮试剂10mL加入到50mL发酵管中，然后小心地自瓶壁各加入不同浓度的海藻糖标准溶液5mL，剧烈摇匀，并迅速浸入冷水浴中冷却，然后置于沸水浴中6min，取出后迅速冷却至室温，用1cm比色皿，在610nm波长下测定吸光度。以吸光度为横坐标，糖液浓度(mg/L)为纵坐标，绘制标准曲线。
2、活性污泥海藻糖的提取
活性污泥内的海藻糖合成贮存在微生物细胞内，须经提取后方可测量。考虑到微生物细胞破壁的可行性与特殊性，可采取一定超声强度的超声波破碎机进行提取。
3、活性污泥中海藻糖含量的测定
向10mL离心管中加入0.8mL的活性污泥混合液置于离心机中，在4500r/min下离心5min;用蒸馏水冲洗、搅拌离心所得活性污泥，在4500r/min下离心5min，反复3次;去掉离心上清液后加入6mL、0.4mol/L的三氯乙酸(TCA)溶液，将其置于超声破碎机中超声处理80min，然后在4500r/min下离心8min，上清液即为海藻糖提取液;取蒽酮试剂10mL加入到50mL发酵管中，小心地沿管壁加入前述离心过程中所得海藻糖提取液5mL，剧烈摇匀，并迅速浸入冷水浴中冷却，然后置于沸水浴中6min，取出后迅速冷却至室温，用1cm比色皿，在610nm波长下测定吸光度，同时将前述离心过程中产生的污泥在(105±1)℃下烘干1h后称重;最后根据吸光度和污泥称重结果计算活性污泥细胞内海藻糖含量。