申请日2011.01.27
公开(公告)日2012.08.01
IPC分类号C12N11/14; C12R1/01; C05F11/08; A01P3/00
摘要
本发明涉及一种柠檬酸废水资源化生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂的方法，属于微生物菌剂和废水资源化技术领域。该方法主要是以柠檬酸生产过程中产生的高浓度有机废水为主要培养基原料，采用液态发酵的方法生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂。生产工艺包括：(1)柠檬酸废水pH调节和灭菌;(2)接种斜面保藏的多粘类芽孢杆菌，振荡培养获得液体种子;(3)向装有柠檬酸废水培养基的发酵罐中接种液体种子，通无菌空气培养得到液态发酵产物;(4)发酵液与生物碳混合获得固体菌剂。该工艺生产的多粘类芽孢杆菌微生物菌剂，具有生产成本低、环境友好的特点，产品能明显改善土壤环境质量、提高作物产量和品质，而且能够防治多种植物病害。同时为柠檬酸生产过程中产生的大量高浓度废水找到有效的资源化利用方法，减少污染物排放。
权利要求书
1.一种利用柠檬酸废水生产多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)微生物菌剂的方法， 其特征在于，该方法是以柠檬酸生产过程中产生的高浓度有机废水为主要培养基原料进 行液态发酵生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂，包括如下步骤：
(1)柠檬酸废水预处理：用氢氧化钠水溶液调节废水的pH到6.5～7.5，于115～126℃ 灭菌10～35分钟;
(2)液体种子制备：向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的多粘类芽 孢杆菌，于30～37℃，120～200转/分振荡培养24～48小时，得到液体种子;
(3)液态发酵：向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为2%～15%的液体 种子，于25～35℃，通无菌空气培养12-48小时;培养好的发酵液经平板细菌计数， 活菌数达到5×108CFU/毫升以上;
(4)菌剂制备：以过30目筛的生物碳为载体，按照发酵液∶生物碳为1∶1.2～5的重 量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含 水量30%以下，包装，存放在阴凉干燥处。
2.权利要求1中所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，其特征在于，该菌株于 2008年2月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC No.2377。
说明书 [支持框选翻译]
柠檬酸废水资源化生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂
技术领域：
本发明属于微生物菌剂和废水资源化技术领域。
背景技术：
柠檬酸作为一种重要的化工原料和食品添加剂被广泛应用于食品、医药、化工等行业。 目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约80万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出 口国，出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重超过60%。柠檬酸的生产是以薯干或玉米为原 料，依次经原料处理、发酵、提取、精制等工序制得产品。柠檬酸废水主要来自发酵和提取 工序产生的中和液、洗糖水、洗罐水和洗滤布水。废水中主要含有淀粉、蛋白质、碳水化合 物、各种有机酸、氨氮和脂肪等，COD浓度为20000～30000mg/L，属于高浓度有机废水。 据统计，每生产1吨柠檬酸，产生高浓度废水7.5～15吨。直接排放会对环境将造成严重污 染，处理达标排放费用高昂。
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)在自然界中分布广泛，是一种重要的生防菌， 对多种植物真菌、细菌病害均有较好的防治作用。王智文等报道了一株多粘类芽孢杆菌 Cp-S316菌株对动植物真菌、细菌病原物具有广谱抗性，利用大孔吸附树脂对多粘类孢杆菌 Cp-S316产生的抗真菌活性物质的吸附、解吸性能，筛选出其最佳解吸剂，该活性物质对热、 紫外线稳定，对胰蛋白酶、蛋白酶K有一定的耐受性，对氯仿部分敏感，对酸稳定，对碱敏 感(王智文，袁士涛，何亮等，多粘类芽孢杆菌Cp-S316抗真菌活性物质的提取及其部分性质 研究，农业环境科学学报，2007，26(4)：1464-1468)。中国专利(授权公告号：CN 1169942C) 中报导培养的Paenibacillus polymyxa HY96-2及其发酵上清液可以用来防止植物细菌性青枯 病，而且还可用来防治植物苗期立枯病，猝倒病，以及黄瓜枯萎病，番茄枯萎病，茄子枯萎 病，大豆根腐病，并且对植物具有十分明显的促进生长作用。中国专利(授权公告号：CN 1186441C)中公开了Paenibacillus polymyxa可以作为微生物肥料菌剂中的一种成分分解秸秆， 有效解决农业生产中一方面农业垃圾过多，污染水体和环境，处理困难，另一方面化肥，农 药使用过多，土壤恶化的矛盾。中国专利(授权公告号：CN 1325635C)中公开了Paenibacillus polymyxa Jaas cd可以在较低的浓度下进入植物体内，并能在植物体内定植，繁殖和传导;对 植物同时具有促进生长，提高产量，防病抗病的作用，特别是对土传维管束病害具有良好的 防治效果。
多粘类芽孢杆菌的生产方法有多种，如：中国专利(公开号：CN 1844360A)中公开了 一种多粘类芽孢杆菌的生产方法，其培养基为豆渣。中国专利(授权公告号：CN 1186441C) 中使用庖肉培养基作为多粘类芽孢杆菌发酵培养基。以柠檬酸废水为主要培养基原料生产多 粘类芽孢杆菌微生物菌剂的方法未见文献报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能够资源化利用柠檬酸废水生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂的 方法。
本发明所使用的菌株是由发明人分离筛选出来的一株高效促进植物生长、拮抗植物病原 菌的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)EBL-06菌株，该菌株于2008年2月26日保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2377，保藏 单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明所述的多粘类芽孢杆菌微生物菌剂的生产方法如下：
1、柠檬酸废水预处理：用氢氧化钠水溶液调节废水的pH到6.5～7.5，于115～126℃灭 菌10～35分钟。
2、液体种子制备：向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的多粘类芽孢 杆菌，于30～37℃，120～200转/分振荡培养24～48小时，得到液体种子。
3、液态发酵：向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为2%～15%的液体种 子，于25～35℃，通无菌空气培养12-48小时;培养好的发酵液经平板细菌计数， 活菌数达到5×108CFU/毫升以上。
4、菌剂制备：以过30目筛的生物碳为载体，按照发酵液∶生物碳为1∶1.2～5的重量 比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水 量30%以下，包装，存放在阴凉干燥处。
具体实施方式：
由本发明技术方案生产的多粘类芽孢杆菌微生物菌剂能够促进作物对养分的吸收和利 用，减少化肥的使用量，能有效防治多种真菌类植物病害，减少农药的使用量，从而改善农 田环境质量;而且生产成本低，有效地利用了废水，减少污染物排放。具体实施方式如下：
实施例1：柠檬酸废水生产多粘类芽孢杆菌微生物菌剂
柠檬酸废水预处理：用氢氧化钠水溶液调节废水pH到7.0，于121℃灭菌20分钟。
液体种子制备：向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的多粘类芽孢杆 菌，于32℃，150转/分振荡培养30小时，得到液体种子。
液态发酵：向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种5%(体积比)的液体种子，于 32℃，通无菌空气培养16小时;培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到3×109CFU/ 毫升。
菌剂制备：以过30目筛的生物碳为载体，按照发酵液∶生物碳为1∶2的重量比，将发 酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水量30%以下，包 装，存放在阴凉干燥处。
实施例2：多粘类芽孢杆菌微生物菌剂应用于油菜生产
采用蔬菜大棚小区实验，设置8个条件完全相同的实验小区，每个小区60m2，2个小区 为1组平行试验，共分成4组，种植油菜，在油菜幼苗期，第1组2个小区不施肥作对照; 第2组2个小区按照50公斤/亩的用量在油菜完全发芽后和3周后各追施多粘类芽孢杆菌微 生物菌剂一次;第3组2个小区按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用 尿素一次;第4组2个按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次， 并在每次施用尿素后1天按照50公斤/亩的施肥量追施微生物菌剂一次，各小区相同的灌溉 和管理方式。油菜生长5周后调查产量和品质。单独施用微生物菌剂和单独施用尿素的油菜 产量基本一致，都比不施肥的对照小区增产60%左右;两种肥料都施用的比对照小区增产90 %左右;油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量以不施肥和单独施用微生物菌剂的最低，还不到国家 标准限量值的1/3，施用尿素后又施用微生物菌剂的也不到国家标准限量的1/2，而单独施用 尿素的油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量都超标严重。表明该微生物菌剂既有良好的增产效果， 又可以明显提高油菜的品质。
实施例3：多粘类芽孢杆菌微生物菌剂防止黄瓜猝倒病
黄瓜猝倒病是由真菌侵染引起的病害。采集多年种植黄瓜的温室大棚中的土壤，混合均 匀，装入花盆中，设置2组花盆，每组10盆，至于15℃～16℃的温室中，保持较高湿度和 较低的光照强度。第1组花盆直接播种黄瓜种子，每盆30粒，作为对照。第2组播种黄瓜种 子前向土壤中拌入重量比为0.2%的多粘类芽孢杆菌微生物菌剂，然后每盆播种30粒种子。 幼苗出土后统计总数，幼苗长出1片真叶后，2片真叶前统计倒伏苗总数。结果表明，对照 幼苗倒伏率超过50%，而添加菌剂的实验组，幼苗倒伏率低于10%。