申请日2012.10.22
公开(公告)日2013.01.16
IPC分类号C12Q1/68
摘要
本发明公开了一种污水生物处理系统诊断和修复的方法，其步骤如下：1)确定参比系统;2)对参比系统取样;3)提取样品中的DNA，16sRNA V3区进行PCR扩增，然后进行DGGE指纹图谱分析;4)对DGGE指纹图谱标准化;5)对DGGE指纹图谱的主成份分析，鉴定DGGE条带;6)实时PCR定量确立主成份的演替规律。本发明通过对比分析微生物空间演替出现问题，找出运行系统存在问题，对故障系统进行诊断，提出系统修复建议。该方法主要应用于污水处理系统中问题诊断、功能恢复以及功能优化。
权利要求书
1.污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)确定参比系统;
2)对参比系统取样;
3)提取样品中的DNA，16sRNA V3区进行PCR扩增，然后进行DGGE指纹 图谱分析;
4)对DGGE指纹图谱标准化;
5)对DGGE指纹图谱的主成份分析，鉴定DGGE条带;
6)实时PCR定量确立主成份的演替规律。
2.按照权利要求1所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，所述1)步骤确定的参比系统为处理工艺相同、进水水质及规模大致 相同、出水要求相同且系统运行稳定至少半年以上的污水生物处理系统，系 统运行稳定主要是指出水各指标能够达到国家相应出水要求，且日浮动范围 不超过5%。
3.按照权利要求1所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，所述2)步骤中，在取样前对系统进行分区，分为厌氧区、缺氧区和 好氧区。
4.按照权利要求1所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，所述3)步骤的PCR扩增引物括上游引物GC-341f(5’ -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 下游引物907r(5’-CCGTCAATTCCTTT[A/G]AGTTT-3’)两种。
5.按照权利要求4所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，在对样品进行扩增后再进行复原条件PCR，将PCR产物稀释10倍后作 为新的模版再进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系与第一轮相同，循环3次， 以消除PCR产物中单链DNA的影响，最后对PCR结果做变性葡聚糖凝胶，凝 胶成像，分别建立DGGE指纹图谱。
6.按照权利要求1所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，所述DGGE图谱标准化是利用Image J软件将DGGE图谱条带的亮度和 迁移位置数字化，后利用公式：条带亮度=直接从胶上读取的条带亮度×100/ 每个泳道内所有条带亮度之和将条带的亮度标准化。
7.按照权利要求1所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，DGGE图谱的主成份分析是将标准化的条带亮度数据，在遗传变方变积 矩阵的基础上进行PCA分析;找到DGGE图谱中主成分的电泳条带。
8.按照权利要求1所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，DGGE条带鉴定是重点对主成分电泳进行鉴定，确立主条带所代表的微 生物种属。
9.按照权利要求1所述的污水生物处理系统诊断和修复的方法，其特征 在于，实时PCR定量确立主成份的演替规律是通过实时PCR定量分析，跟踪 监测废水处理工艺中各环节中主成分微生物种群的空间或时间演替，最终确 立各主成份在水处理系统中的空间演替轨迹。
说明书
污水生物处理系统诊断和修复的方法
【技术领域】
本发明涉及污水处理中的生物处理系统技术领域，具体为一种污 水生物处理系统诊断和修复的方法。
【背景技术】
厌氧-缺氧-好氧(A/A/O)系统，缩写为污水处理系统，是工业有机废水常 用的处理系统。该系统的本质作用原理是依次利用厌氧微生物、兼性微生物、 好氧微生物将废水中的有机物同化为微生物本身的结构组成或生成CO2等无 机成分。因此，在污水处理系统的各个环节中，相应微生物的组成与生理状 态，直接决定着有机废水的处理效果。废水处理的最终效果，则是各个处理 环节中的微生物相互协同的结果。换言之，要保证废水的处理质量，就必然 要求各处理环节中的微生物必须有针对废水有机物特征的稳定的微生物组成 结构。污水处理系统实际上是一种人工的微生态系统。在这个微生态系统中， 由于各环节相互衔接与协同，致使微生态的组成在空间上有演替，在时间上 有变更。自然，可以将出现故障的废水处理系统看作是一个退化的或者遭到 破坏的生态系统，如果这个生态系统能够恢复到正常状态，那么废水处理的 功能也能够得到恢复，所以对系统故障的诊断和排除过程实际上也是一个生 态修复过程。因此生态恢复的理论和方法对于废水处理系统的修复具有重要 的指导作用。
虽然人们对于污水处理反应器的设计和操作的优化上做了大量的研究， 并已经积累了一些优化经验，但是这些经验都是在忽略微生物群落的作用， 只是把反应器中的微生物群落看作是一个黑箱，通过控制溶解氧、水停留时 间、污泥龄等参数和监控参数比如NH3-N，NO3--N，PO43--P等参数，一般能在 较低的成本下实现污染控制指标(比如BOD，氮和磷)的达标排放。这样做， 虽然能够在很多情况下达到反应器的优化和稳定运行的目的，但是因为因为 这些优化措施没有考虑到微生物群落的影响，会损坏了反应器中正常的微生 物群落结构，因此优化的效果往往是短期的。例如，高BOD去除率可以采用 调整物理化学参数(曝气量、污泥浓度等)的措施来达到，往往容易达到较 高BOD去除率，但反应器中BOD浓度的降低也增加了丝状菌和有益菌种因碳 源发生竞争而导致污泥膨胀发生的可能性，此时如果不再继续优化微生物群 落结构，控制丝状菌的过量生长，污泥膨胀一旦发生，整个污水处理过程就 会崩溃。这说明忽略微生物群落作用的优化措施往往是以牺牲其他来达到的， 而这种优化往往也是不稳定的，在经过短期明显效果后，一般会出现另外一 种或者几种问题，系统不稳定。又比如Manefield等分析比较了两个焦化废 水工业处理装置之间效果差异的原因。这两个废水装置处理量、反应器结构 和操作基本相同，但是却存在一个处理效果稳定，而另一个效果不稳定的问 题，常规的优化很难发现问题所在，他们从微生物群落角度出发，通过使用 RNA-SIP技术，发现了这两个反应器群落之间苯酚降解同位群存在结构差别： 在两个反应器中虽然同一种未培养Acidovorax属种群的苯酚降解同位群中 都占优势地位，但是在处理效果不稳定的反应器中还含有另外一种优势苯酚 降解种群。这种重要同位群结构上的差别很可能是导致处理装置不稳定的根 本原因。
最近几年，人们已经意识到在反应器优化的过程中考虑微生物群落结构、 优化的必要性。但是由于意识和手段的限制，我们对反应器中微生物菌群结 构都是从纯培养角度出发的，对于污水处理系统中微生物群落中各个菌群的 组成、多度、分布以及它们在运行过程中的生理学特点(如生长动力学和对 不同底物的亲和力及利用效能等)都缺乏全面而正确的认识。这些知识的缺 乏，限制了微生物的群落结构演替在反应器优化中的应用。
【发明内容】
本发明的目的在于针对以上所述现有技术存在的不足，提供一种对污水 生物处理系统中群落的时间或者空间演替进行系统轨迹分析的污水生物处理 系统诊断和修复的方法。
为了实现上述目的，本发明是这样实现的：污水生物处理系统诊断和修 复的方法，其包括的步骤如下：
1)确定参比系统;
2)对参比系统取样;
3)提取样品中的DNA，16sRNA V3区进行PCR扩增，然后进行DGGE指纹 图谱分析;
4)对DGGE指纹图谱标准化;
5)对DGGE指纹图谱的主成份分析，鉴定DGGE条带;
6)实时PCR定量确立主成份的演替规律;
8)分析诊断，推断故障具体原因，提出解决方案。
所述1)步骤确定的参比系统为处理工艺相同、进水水质及规模大致相 同、出水要求相同且系统运行稳定至少半年以上(如若无适合的，也可在实 验自行建立一个运行正常，能满足设定废水处理目标的中试系统)的污水生 物处理系统;其中进水、出水水质按照城镇污水处理厂污染物排放标准 (GB18918-2002)的相应标准进行测定(注：有地方标准的要参照地方标准)， 进水水质大致相同是指两个系统的各指标日均值相差不大(不超过30%)，且 日变化幅度大致相同(不超过10%);出水要求相同是指两个系统均要达到相 同的国家或者地方出水水质标准。系统运行稳定主要是指出水各指标能够达 到国家相应出水要求，且日浮动范围不超过5%。
所述2)步骤中，在取样前对系统进行分区，可以分为氧池、缺氧池、 好氧池三个区，系统分区的各个部位(上、中、下)，均要采集污泥样，以增 强样品的代表性。其中系统分区是按照系统不同反应器或者统一反应器中不 同时间点的运行工况的不同进行分区的，可以分为厌氧区(段)、缺氧区(段)、 好氧区(段)。
所述3)步骤的PCR扩增引物括上游引物GC-341f(5’-CGCCCGCCGCGCC CCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和下游引物907r (5’-CCGTCAATTCCTTT[A/G]AGTTT-3’)两种。
且对样品进行扩增后再进行复原条件PCR(Reconditioning PCR)，即 将PCR产物稀释10倍后作为新的模版再进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系 与第一轮相同，循环3次，以消除PCR产物中单链DNA的影响，最后对PCR 结果做变性葡聚糖凝胶，凝胶成像，分别建立DGGE指纹图谱。DGGE指纹图 谱分析的具体条件为:使用D Code通用突变检测系统;变性剂梯度为37-58% (100%变性剂由7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺组成);8%聚丙烯酰胺凝胶， 1×Tris-Acetate-EDTA(TAE，pH8.4)的电泳缓冲液，在电压200V，温度60℃ 的条件下电泳200min，电泳结束后用1×SYBR GreenⅠ(AMRESCO公司)染 色，然后用UVI凝胶成像系统保存实验结果。
所述DGGE图谱标准化可以利用Image J软件 (http://rsb.info.nih.gov/ij/)将DGGE图谱条带的亮度和迁移位置数字 化，后利用公式：条带亮度=(直接从胶上读取的条带亮度×100/每个泳道内 所有条带亮度之和)将条带的亮度标准化;
DGGE图谱的主成份分析是将标准化的条带亮度数据，在 variance-covariance(遗传变方变积)矩阵的基础上进行PCA分析 (principal component analysis)。用SPSS软件进行PCA分析。
DGGE条带鉴定是对主成分的电泳进行鉴定，确立主条带所代表的微生物 种属即优势菌属。
实时PCR定量确立主成份的演替规律是通过实时PCR定量分析技术，具 体操作是对每个反应器或者时间点的每个优势菌属进行PCR定量分析，确定 优势菌属含量，作为一个点，将每个反应器或者每个时间点所对应的点在二 维空间连接起来就组成一条空间演替轨迹。
探究故障系统空间演替轨迹的操作与参比系统的完全相同，即通过PCR 定量分析技术，建立故障系统的空间演替轨迹。故障诊断方式为对比分析故 障系统与参比系统确立的主成份的空间演替轨迹。找出故障系统与参比系统 中在群落演替中起重要作用的微生物种群及所在位置。结合故障系统存在问 题，找出系统问题原因，完成对系统故障的诊断。进而利用系统诊断采取相 应的处理措施，对系统进行修复。
本发明将PCR-DGGE和实时定量PCR等分子生态学技术与主成分分析 (principal component analysis,PCA)相结合可以对系统中群落的时间或 者空间演替进行系统轨迹分析。PCR-DGGE能够同时测定空间上或者时间上多 个微生物群落的结构。PCR-DGGE指纹图谱中每一条带迁移位置和亮度的数字 化可以将指纹图谱与高维空间中的一个点相对应，将这些点沿着时间或者空 间方向连接起来就可以得到系统的群落空间演替轨迹。这些高维空间的系统 轨迹非常复杂，为了便于分析比较，还必须借助PCA分析对系统轨迹的主要 特征进行提取，然后在一个二维或者三维空间里把系统轨迹直观地展现出来。 在PCA分析的基础上，再对那些主成分DGGE条带进行鉴定，就可以知道哪 些种群是推动群落演替进行的重要种群。进一步可以用实时定量PCR对这些 重要种群在演替过程中的动态变化进行定量测定，以消除PCR的偏好性以及 DGGE的分辨能力等方法偏差对于实验结果的影响。
与现有技术相比，本发明有如下优点：对于污水生物处理系统问题诊断， 现有技术主要是通过改变运行方式，例如改变水力停留时间(HRT)、污泥龄 (SRT)、曝气量等方式，实现对各种污染物(比如BOD，氮和磷)的达标排 放，这种方式虽然在很多情况下能够实现反应器的控制，他们因为微生物群 落间的相互作用和交流，往往会同时损坏了反应器中正常的微生物群落结构， 影响了微生物正常功能的发挥，因此效果往往是短期的。本发明针对现有技 术的不足，提出了一种污水生物处理系统诊断和修复的方法。利用参比系统 和故障系统微生物群落空间演替的不同对故障系统出现的问题进行诊断和排 除，是一种准确、高效的污水生物处理系统诊断和修复方法。