申请日2014.09.17
公开(公告)日2014.12.24
IPC分类号C12N1/20; C12R1/40; C02F3/34
摘要
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种利用反硝化聚磷菌株(B8)去除印染废水中硝酸盐氮和总磷的方法。反硝化聚磷菌株B8，现保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.9168。经鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida sp.。利用上述菌种制备的菌液按以质量分数计为10%比例的投菌量投到印染废水中，在26-30℃下分别经厌氧-好氧流程或厌氧-缺氧流程处理9-25小时即能有效去除印染废水中硝酸盐氮和总磷。
权利要求书
1.反硝化聚磷菌菌种保藏编号为CGMCC NO.9168，命名为B8，经鉴定为恶臭假 单胞菌Pseudomonas putida sp.。
2.利用权利要求1所述的菌种去除印染废水中硝酸盐氮和总磷的方法，其特征按 照下述步骤进行：B8菌株接种于pH6.5的50mL的自制DNJPU的培养液中，放 置于振荡培养箱(温度30℃，转速120r/min)中进行培养20h，得到B8菌液。 将此菌液按照投菌量以质量分数计为10%的比例接种到印染废水中，在26-30℃ 下分别经厌氧-好氧流程或厌氧-缺氧流程处理9-25小时即能高效去除其中的硝 酸盐氮和总磷。
3.根据权利要求2所述的去除印染废水中硝酸盐氮和总磷的方法，其特征在于其 中所述的DNJPU培养液组成如下：(NH4)2SO42.75g;Na2HPO430.6g;KH2PO43g;MgSO4·7H2O 0.25g;CaCl20.25g;柠檬酸钠4.0g;NaCl 2.5g;蔗糖0.01g; 蒸馏水1000mL。
说明书
一种利用反硝化聚磷菌株(B8)去除印染废水中硝酸盐氮和总磷的方法
技术领域
本发明涉及一种利用反硝化聚磷菌株(B8)去除印染废水中硝酸盐氮(NO3--N)和总磷(TP)的方法，属于污水处理技术领域。
背景技术
反硝化聚磷菌(denitrifying poly-phosphate accumulating organisms，DNPAOs)是一类以氧或硝酸盐氮为电子受体聚磷的菌群，在厌氧环境中DNPAOs释放体内的多聚磷酸盐(Poly-P)获得能量吸收水体中的挥发性脂肪酸，将其储存为聚羟基脂肪酸酯(PHA);在好氧或缺氧环境中再消耗PHA，以氧或硝酸盐氮为电子受体超量吸收水中的磷，并在菌株体内再次合成Poly-P。利用反硝化聚磷菌进行生物脱氮除磷，既节约了投加化学药剂除磷所增加的成本，又可以减少化学除磷产生化学污泥。中国发明专利(授权公告号：CN 102776145A)公布了一种反硝化聚磷菌CL-3(Pseudomonas oleovorans)与人工湿地系统中的植物协同作用，有效的净化生活污水。中国发明专利(申请公告号CN 101386822A)公开了一株特效聚磷菌HJP07(Pseudomonas sp.)在30℃、150r/min摇床上培养至对数生长期后将其投加入强化淹没生物膜-活性污泥的好氧段中且使系统反应池中的聚磷菌浓度大于104CFU/L，14d后系统稳定运行其除磷率稳定于86.2%以上。
作为高效脱氮除磷的反硝化聚磷菌主要用于降低污水中的氮、磷浓度。近年来我国印染纺织产品产量大幅增长，与此同时印染废水水量、氮和磷排放量也不断在增加。据不完全统计我国印染废水的排放量约为9×109～12×109m3/a，约占整个工业废水排放量的35%。我国污水处理厂多采用氧化沟和A2/O工艺来对印染废水中的氮、磷进行去除，这些工艺在原理上有利于反硝化聚磷菌发挥其效能，但多数污水处理厂均不同程度存在氮磷去除率不高的问题，其原因在于反硝化聚磷菌与硝化菌、聚糖菌等存在碳源竞争，以及由于近年来化学纤维织物的发展、仿真丝的兴起和印染后整理技术的进步，使PVA浆料、人造丝碱解物、新型助剂等难生化降解有机物大量进入废水，使污水处理厂活性污泥中微生物活力降低，若反硝化聚磷菌在活性污泥中失去种群优势，则活性污泥中的反硝化聚磷菌很难大量繁殖。为确保达标排放，只得采用投加大量的化学药剂，但这又会带来成本过高和污泥量增加的问题，进而最终造成运行成本过高，尤其是采用BOT模式建造的纺织园区污水处理厂更是苦不堪言。
国内外对反硝化聚磷菌进行了一些研究，主要有反硝化聚磷菌筛选、分离纯化、菌种在 待处理废水中的降解规律和菌种固定化处理。《环境科学与技术》2008年第31卷第12期56-62页报道了唐艳葵采用海藻酸钠和PVA添加膨润土包埋固定经富集驯化以反硝化聚磷菌为主的活性污泥，包埋小球在厌氧/好氧条件下COD去除率达74.9%，除磷率达95.3%，氨氮去除率可达95.2%。《安徽农业科学》2011年第39卷第18期11040-11046页报道了刘艳萍等采用牛肉膏蛋白胨培养基进行平板分离技术，从城市河道底泥中筛得3株反硝化聚磷菌DPB-A511(Dechloromonas aromatic)、DPB-A9(Candidatus accumulibacter phosphatis)和DPB-A10(Bacillus pumilus)，其聚磷率与脱氮率均达到50%。而在国内的反硝化聚磷菌菌种获得过程中的其处理对象大多采用富磷培养基或者是配制的模拟废水(其实质也是富磷培养液)，如此筛得的菌株投加到印染废水中往往不表现除磷功能甚至自溶死亡，也正因为如此，虽现已筛得大量聚磷菌，但鲜有聚磷菌微生物制剂和聚磷菌干粉菌剂在市面上出售和推广运用案例。
本发明从安徽省天长市污水处理厂具有较高除磷效率(70%-80%)活性污泥中获取的反硝化聚磷菌进行优化培养，对菌液优化培养条件和投菌处理印染废水做了初步探究，以期为反硝化聚磷菌菌剂制备和使用提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用反硝化聚磷菌株(B8)菌液去除印染废水中硝酸盐氮(NO3--N)和总磷(TP)的方法。
上述的反硝化聚磷菌菌株是由本实验室从安徽省天长市污水处理厂的氧化沟外沟中的活性污泥中分离筛选出来的。将其编号为B8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年5月16日，分类命名为恶臭假单胞菌属(Pseudomonas putida sp.)，其登记入册编号为：CGMCC No.9168。该菌株具有如下性质：
①菌落形态特征及菌体形态特征
在DNJPU固体培养基上菌落呈圆形、凸起、边缘呈现锯齿状、牛奶色的光滑型菌落。在NB液体培养基中培养24h后呈现墨黑色，革兰氏染色、乙酰甲基醇(V.P)、甲基红(M.R)、淀粉水解和葡萄糖发酵皆为阴性，接触酶、明胶水解、葡萄糖氧化和产硫化氢均为阳性。
②16S rDNA基因序列
用27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)与1492R(5’-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’)为引物进行扩增该菌株的部分16S rDNA序列，通过部分16S rDNA序列构建系统发育树来进行菌种种属分析，结果表明其与恶臭假单胞菌的相似性最高，达到99%以上。
上述的的菌液的生产方法如下：
①培养基配制：a)NB培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，pH7.2～7.4，加水至1L。b)DNJPU种子培养基(液体，1L)：(NH4)2SO42.75g，Na2HPO430.6g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 0.25g，CaCl20.25g，柠檬酸钠4.0g，NaCl 2.5g，蔗糖0.01g，加水至1L。c)DNJPU培养基(固体，1L)：(NH4)2SO42.75g，Na2HPO430.6g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O0.25g，CaCl20.25g，柠檬酸钠4.0g，NaCl 2.5g，蔗糖0.01g，琼脂粉20g。以上培养基均在1.03×105Pa，121℃下灭菌20min。
②菌种活化：用接种笔挑取1环反硝化聚磷菌B8至DNJPU固体培养基平板，连续“S”型划线分离提纯3次在30℃下培养，再将平板上的单一菌落转接于DNJPU固体培养基斜面上30℃培养1d后置于4℃下对B8进行保藏。挑取1环B8菌接种于50mL的NB液体培养基中，在30℃，120r/min摇床上摇晃培养过夜。
③液体种子液的制备：按照10%的投菌量将活化后的B8接菌于50mL高温蒸汽灭菌后的DNJPU种子培养基中，于30℃，120r/min，pH 6.5摇床摇晃培养20h，得到液体种子菌液。
上述的利用反硝化聚磷菌株(B8)菌液去除印染废水中总磷和硝酸盐氮的方法，按照下述步骤进行：
用无菌水4000r/min离心15min清洗3次高Poly-P含量的反硝化聚磷菌B8种子菌液，再将其按10%接菌量投加至印染废水后，进行厌氧—好氧流程处理或者厌氧—缺氧流程处理。其中：
(1)厌氧—好氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中，再向150mL的容器中投入磁力转子再充入氮气5min后立即拧紧瓶塞，充分振荡后置于控温磁力搅拌器(30r/min)中转子搅拌处理，此作为厌氧处理。再将水样置于盖有8层纱布的敞口容器中摇床振荡充氧培养，此为好氧处理。处理后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP、NO3--N浓度，并计算其去除率。
(2)厌氧—缺氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中，再向150mL的容器中投入磁力转子再充入氮气5min后立即拧紧瓶塞，充分振荡后置于控温磁力搅拌器(30r/min)中转子搅拌处理，此作为厌氧处理。缺氧处理为将水样置于敞口容器中进行间歇低速搅拌培养，即将容器置于摇床每隔55min以60r/min的转速振荡5min。处理后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP、NO3--N浓度，并计算其去除率。
由本发明技术方案生产的反硝化聚磷菌B8菌液能对印染废水中的总磷和硝酸盐氮进行有效的去除。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
具体实施方式
用接种环挑取1环B8菌株接种于50mL的NB液体培养基中，在30℃，120r/min摇床上摇晃培养过夜。再将活化后的B8菌液以10%的量接入调节pH为6.5的DNJPU培养液中，放置于振荡培养箱(30℃;120r/min)中进行培养20h，得到液体种子菌液B8。
以下提供本发明的4个实施例：
实施例1
本实施例处理印染废水150mL，pH=7.0，TP=4.32mg/L，NO3--N=35.81mg/L，COD=269.5mg/L，主要进行菌液的厌氧—好氧流程的脱氮除磷试验。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8种子菌液，再按10%投菌量投加至印染废水后，进行厌氧—好氧流程处理。厌氧—好氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度26℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床(26℃，120r/min)中好氧培养21h后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N浓度。初始水样TP=4.32mg/L经4小时厌氧释磷为5.74mg/L，经21小时好氧处理后TP降为2.47mg/L，得到B8菌处理后的除磷率为42.82%。而在好氧除磷过程中，NO3--N浓度变动不明显，其去除率仅为在1.08%至2.24%。
实施例2
本实施例处理印染废水150mL，pH=7.0，TP=4.40mg/L，NO3--N=36.15mg/L，COD=267.2mg/L，主要进行菌液的厌氧—好氧流程的脱氮除磷试验。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8种子菌液，再按10%投菌量投加至印染废水后，进行厌氧—好氧流程处理。厌氧—好氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度30℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床(30℃，120r/min)中好氧培养5h后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N浓度。初始水样TP=4.40mg/L经4小时厌氧释磷为5.80mg/L，经5小时好氧处理后TP降为0.26mg/L，得到B8菌处理后的除磷率为94.09%。而在好氧除磷过程中，NO3--N浓度变动不明显，其去除率仅为在1.32%至2.13%。
实施例3
本实施例处理印染废水150mL，pH=7.0，TP=4.38mg/L，NO3--N=35.94mg/L， COD=274.4mg/L，主要进行菌液的厌氧—缺氧流程的脱氮除磷试验。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8种子菌液，再按10%投菌量投加至待处理废水后，进行厌氧—缺氧流程处理。厌氧—缺氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度30℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床(30℃，60r/min)中每隔55min搖晃5min缺氧培养5h后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N浓度。初始水样TP=4.38mg/L经4小时厌氧释磷为5.87mg/L，经5小时缺氧处理后TP降为2.46mg/L，得到B8菌处理后的除磷率为43.84%。而在缺氧除磷过程中，初始水样NO3--N=35.94mg/L经过4小时厌氧和5小时缺氧处理后NO3--N降为24.08mg/L，得到硝酸盐氮去除率为33.44%。
实施例4
本实施例处理印染废水150mL，pH=7.0，TP=4.38mg/L，NO3--N=35.94mg/L，COD=274.4mg/L，主要进行菌液的厌氧—缺氧流程的脱氮除磷试验，此与实施例3缺氧处理的时间不同，其余水质参数均相同。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8种子菌液，再按10%投菌量投加至待处理废水后，进行厌氧—缺氧流程处理。厌氧—缺氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度30℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床(30℃，60r/min)中每隔55min摇晃5min缺氧培养12h后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N浓度。初始水样TP=4.38mg/L经4小时厌氧释磷为5.87mg/L，经12小时缺氧处理后TP降为0.45mg/L，得到B8菌处理后的除磷率为89.73%。而在缺氧除磷过程中，初始水样NO3--N=35.94mg/L经过4小时厌氧和12小时缺氧处理后NO3--N降为16.72mg/L，得到硝酸盐氮去除率为53.48%。