一、前言
目前，我国啤酒工业发展迅速，啤酒产量不断增加，与此同时啤酒废水的产生量也是逐年增加，例如，2002年我国啤酒废水的排放量为2.7亿杆，占全国工业废水排放总量的1.3%。啤酒生产经历制麦、糖化、发酵、罐装等多道工序，产出废水包括糖化废水、洗涤废水、废酵母液和冷却废水等，一般每生产1t啤酒产生3-10t啤酒废水。虽然啤酒废水无毒，但是直接排放仍然会造成严重的环境污染。因此，如何能高效低能耗地处理发酵类型废水成为备受关注的环境问题之一。啤酒废水的主要成分有大量的淀粉、蛋白质、残余啤酒以及洗涤用碱，其COD—般在2000-4000mg/L。由于啤酒废水的可生化性较高，目前主要采用生物处理法处理，最常见的是厌氧与好氧联合生物处理法
厌氧生物处理技术具有污泥产率低、容积负荷高、运行稳定性强、能耗低、可回收清洁能源和运行管理费用低等特点，因而被广泛推广与应用。目前厌氧反应器形式主要包括厌氧过滤器(AF)、厌氧流化床反应器(AFBR)、上流式厌氧污泥床反应器(UASB)、膨胀颗粒污泥床反应器(EGSB)和内循环厌氧反应器(IC)。IC反应器是由上下两个UASB反应器串联组合而成，上部是低负荷区，底部是高负荷区，通过沼气上升的方式使泥水充分混合。由于处理效果好、管理方便、运行稳定，特别适用于处理高浓度的有机废水，因而被广泛应用在啤酒废水处理中，取得了较好的处理效果。本啤酒厂废水的厌氧生物处理主要采用IC工艺，Q反应器对废水COD的去除率达到了80%。在废水的生物厌氧处理系统中，微生物多样性对废水处理效果的影响最为直接，为了更进一步了解废水处理过程的内在机制，有必要对啤酒废水主要工艺的微生物区系进行研究，并对厌氧污泥中的优势功能微生物进行分离鉴定。
二、材料和方法
2.1污泥及废水的采集
啤酒废水取自啤酒厂废水处理调节池。经测定，该废水具有高COD和低氨氮的特点。以所取厌氧污泥为接种物，对该污泥进行微生物多样性的分析，并从中分离功能微生物。
2.2厌氧污泥微生物多样性分析
微生物的全基因组采用DNA提取试剂盒(北京庄盟)进行提取。以提取的基因组为模板，以通用引物515F/806R(515F：5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3';806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')扩增16SrRNA基因的V4区。将扩增的样品送至上海美吉生物医药科技有限公司，利用IlluminaMiSeq测序平台进行测序和微生物多样性分析。
2.3优势功能微生物分离筛选
直接向啤酒废水中加入(/L)：NH4CI.25g，NaH2PO4，2H2O0.08g和NaHPO40.25g，利用高压蒸汽灭菌(121°C，20min)后作为微生物分离鉴定及培养的培养基。利用高纯氮对培养基进行充气，以去除培养基中的氧气。采用液体稀释法分离厌氧污泥中的优势功能微生物：称取0.1g污泥介入上述培养基中培养7d作为接种物;将接种物在新鲜液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配到w1个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的几率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过95%)表现为不生长。经过多轮的稀释得到纯培养的微生物，即为厌氧污泥中的优势功能微生物。
2.4微生物鉴定
使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取所分离出的细菌的基因组。以细菌基因组为模板，利用细菌16srRNA基因扩增通用引物27f和1492r，27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。Per扩增反应的条件：95℃的条件下预变性6min，95°C的条件下变性45s，55°C的条件下退火45S，72°C的条件下延伸90s，第二步到第五步循环30次，72°C的条件下延伸10min，per反应结束4°C下保存。扩增成功后得到的样品需送往华大基因科技有限公司进行测序，16srRNA基因的测序引物和扩增引物相同。利用BLASTN程序将测出的基因序列与已承认的所有已知细菌的16srRNA基因进行比对(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得所测序列与已知序列之间的相似性数据。获得相似度较高的序列之后，利用mega7.0对所获得的每种基因的序列进行多序列比对，利用多序列比对的结果构建系统发育树⑷。通常采用邻接法、最大似然法和最大简约法构建进化树，其中邻接法最常用，自展值常设定为重复1000次计算。
2.5废水分析方法
啤酒废水及出水样品指标利用化学需氧量(COD)以及乙酸、丙酸、乳酸和乙醇含量来表征。COD测定：样品用Milli-Q水稀释10倍后COD快速测定仪(5BT型COD快速测定仪，连华科技，中国)测定COD。
样品经12000xg离心2min后取上清液过0.22pm滤膜，用于乙酸、丙酸、乳酸和乙醇含量测定。乙酸、丙酸采用高效液相色谱仪(岛津LC-20AT，岛津，日本)测定。色谱条件：岛津C18柱(4.6x150nm，5pm);流动相：48rnM磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至2.15);柱温：30°C;进样量10[1L;流速1.0mL/min;检测波长210nm。乳酸采用高效液相色谱仪(岛津LC-20AT，岛津，日本)测定。色谱条件：岛津C18柱(4.6x250nm，5pm);流动相：0.1%磷酸水溶液：乙月青=98：2(V：V);柱温：35°C;进样量100mL;流速1.0mL/min;检测波长210nm。
乙醇采用配有FID检测器气相色谱仪(Agilent7890A，Agilent，USA)、顶空进样器(Agilent7697A，Agilent，USA)、OV-1毛细管柱(30mx0.32mmx0.25mm)测定。顶空进样器条件：平衡温度80t;定量管温度：95匸;传输线温度：95°C;平衡时间：10nnin;进样量：1.0mL。色谱条件：进样器温度：150°C;柱温箱温度：60°C;FID检测器温度：300°C;载气为高纯氮，柱流量50mL/min;氢气流量50mL/min;助燃空气流量350mL/min;清扫40mL/min;尾吹10mL/min;分流比为25：4。
三、结果与讨论
3.1微生物多样性分析
对污泥所包含的微生物种类及数量进行分析，按照占比排序位于前十名的微生物如图1所示。结果表明，污泥中包含大量未经鉴定的新型微生物，约占微生物总量的30%，此外还有(按照丰度顺序排列)：Syntrophobacterspp.(17.4%)，Methanobacteriumspp.(7.3%)，Geobacterspp.(1.5%)，Enterococcusspp.(0.9%)，Veilonellaspp.(0.7%)，Prevotellaspp.(0.7%)，Acinetobacterspp.(0.5%)，Desulfovibriospp.(0.3%)，Zoogloeaspp.(0.2%)和Streptococcusspp.(0.2%)„按照文献报道，Syntrophobacter是一类互营微生物，可以在多种互营体系中降解丙酸，Methanobacterium是已知的很重要的一类产甲烷菌，可以利用乙酸或者二氧化碳产生甲烷，这可能是厌氧污泥产沼气的重要功能微生物问，而Geobacter可以降解乙醇和乙酸等多种简单化合物，而且可以和Methanobacterium互营生长。
3.2优势功能微生物分离鉴定
利用梯度稀释法从厌氧污泥中分离到了一株优势功能微生物，将其命名为ZX—菌株。将分离的优势功能微生物进行分子鉴定，结果显示菌株ZX-1与已知的GeobactermetallireducensGS-15的16SrRNA基因相似度为99.4%。系统分类学结果显示，菌株ZX-1与G.metallireducensGS-15进化关系最近(图2)。根据文献报道，GeobactermetallireducensGST5可以降解乙酸、乙醇和苯甲酸等多种有机物，是一种重要的功能微生物。本实验没有分离出污泥中丰度更高的Syntrophobacter和Methanobacterium可能是因为前者需要和其他微生物进行互营生长很难获得纯培养物而后者是产甲烷菌，需要及其苛刻的厌氧条件因而也很难分离。
3.3菌株ZX-1对啤酒废水处理效果分析
经测定，啤酒废水的COD约为3000mg/L，包含乙酸850mg/L，丙酸400mg/L，乙醇80mg/L和乳酸700mg/L等多种物质。为了分析菌株ZX-1对啤酒废水的处理效果，向啤酒废水中加入磷酸盐和氮源(具体见材料与方法)后作为菌株ZX-1的培养基。按照10%的接种量将菌株ZX-1的种子液接入100ml新配置的培养基中，并于30°C进行培养。每天监测废水中COD及上述各物质的含量。
如图3所示，经过了1天的适应期后，啤酒废水中的COD开始下降，10天后COD降至约1000mg/L，并维持稳定。可见菌株DX-1可去除废水中约67%的COD„在相同的时间内，厌氧污泥对啤酒废水COD的去除率可以高达90%，菌株ZX-1无法达到厌氧污泥的COD去除率，这可能是由于厌氧污泥中的其他微生物，女DAcinebacter和Zoogloea等，可以彻底降解丙酸和乳酸，而菌株ZX-4无法降解丙酸和乳酸导致的(数据未显示)。
如图4和图5所示，菌株ZX-1可在十天内完全降解废水中的乙酸和乙醇，而厌氧污泥可在5天内完全降解废水中的乙酸和乙醇。这是由于，在厌氧污泥中，除了Geobacter菌之外，其他种类的微生物也在发挥着降解乙酸和乙醇的作用。
四、结论
(1)对该厌氧污泥的微生物群落分析结果表明，污泥中包含大约30%未经鉴定的新型微生物，此外占比超过1%的微生物类群还包括Syntrophobacter(17.4%)，Methanobacterium(7.3%)和Geobacter(1.5%)。
(2)从厌氧污泥中分离到了一株优势功能微生物，命名为ZX-1o经鉴定ZX-1属于Geobacter属。菌种ZX-1对啤酒废水的COD去除效率可达到67%，可彻底降解废水中的乙酸和乙醇。(来源：广州南沙珠江啤酒有限公司)