由于大量工业废水的排放、农业的长期过度使用化肥,导致环境水体中氨氮污染严重。而氮是引起富营养化的主要物质。
膜曝气生物反应器(membrane aerated bioreactor, MABR)工艺具有曝气量少、硝化与反硝化一体化、污泥发生量小以及运行管理方便等特点,是传统工艺处理高需氧量废水的一个引人注目的替代工艺,因此受到了世界各国水处理工作者的关注。由于在MABR 生物膜中存在明显的分层现象,从而可以同时实现硝化反应、反硝化反应和异养氧化反应 。
20 世纪80 年代,研究人员发现了好氧反硝化菌,如副球菌pantotropha sp. ,粪产碱杆菌属、假单胞菌等。之后越来越多的研究人员研究并筛选了好氧反硝化菌株 ,在有氧条件下好氧反硝化菌株可以去除氮。
本实验筛选高效脱氮菌,并将其应用于膜曝气生物反应器中进行强化研究,从而增强对废水处理的效果,并利用此类反应器处理含氮废水,从而使反应器具有高效、低耗的优点。
1 实验材料与方法
1. 1 好氧反硝化菌筛菌
1. 1. 1 菌种来源
菌种来源取自西安市第四污水处理厂A2 / O 中曝气池中活性污泥。
1. 1. 2 培养基
培养基选取参考文献。
1)富集培养基。富集培养基由牛肉膏1. 0 g·L - 1 ,蛋白胨5. 0 g·L - 1 和硝酸钾1. 0 g·L - 1 组成。
2)选择性培养基。选择培养基由Na2 HPO4 ·7H2 O 7. 9 g·L - 1 ,KH2 PO4 1. 5 g·L - 1 ,NH4 Cl 0. 3 g·L - 1 ,MgSO4 ·7H2 O 0. 1 g·L - 1 , 丁二酸二钠4. 7 g·L - 1 ,KNO3 2. 0 g·L - 1 ,NaNO2 1. 0 g·L - 1 组成,pH 值在7 ~ 7. 5 之间。
3)平板分离培养基。平板分离培养基由Na2 HPO4 ·7H2 O 7. 9 g·L - 1 ,KH2 PO4 1. 5 g·L - 1 ,NH4 Cl0. 3 g·L - 1 ,MgSO4 ·7H2 O 0. 1 g·L - 1 , 丁二酸二钠4. 7 g·L - 1 ,KNO3 2. 0 g·L - 1 ,NaNO2 1. 0 g·L - 1 ,琼脂18 g·L - 1 组成。
1. 1. 3 驯化及平板分离
将选取的活性污泥样品接种至富集培养基,然后在25 ℃ 和160 r·min - 1 的摇瓶中培养5 d,曝气培养。之后将样品接种至平板分离培养基,在25 ℃ 和160 r·min - 1 ,曝气培养5 d。经过平板划线分离纯化后得到菌株。
1. 1. 4 复筛
获得的菌株使用模拟污水(表1)进行复筛,在模拟污水的摇瓶中培养间歇曝气,25 ℃ ,160 r·min - 1下培养5 d,进行复筛。选择TN 去除率高于90% 以上的菌株。
重复上述步骤,得到纯化后菌株。
1. 1. 5 菌种鉴定
采用提取菌株的DNA 并进行聚合酶链反应(PCR) ,扩增后的PCR 样品由上海生工进行基因测序。具体方法为:
1)DNA 提取方法。于200 μL 的离心管中(预先加入30 μL 无菌双蒸水)放入用接种环从培养基中挑出的数个单菌落,在94 ℃ 左右温度下水浴加热2 ~ 3 min 破壁,之后以该液体作为DNA 模板,进行PCR扩增。
2)PCR 扩增引物及程序。上游引物P1:27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),下游引物P2:1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。
PCR 扩增程序如下:94 ℃ 预变性4 min,30 个循环(94 ℃ 变性45 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸90 s),最终72 ℃ 延伸12 min。
反应体系为:无菌双蒸水40 μL,10 × PCR 反应缓冲液5 μL,4 × dNTP 溶液1 μL,10 mmol·L - 1 引物各1 μL,Taq 酶1 个单位,DNA 模板2 μL。
PCR 结果经上海生工生物工程公司测序,结果于美国NCBI 基因库进行比对。
1. 1. 6 细菌形态
利用扫描电镜观察细菌形态。电镜采用Philips XL-30。
1. 2 实验装置
1. 2. 1 反应器构建
本研究采用平行装置运行法,即以同样运行条件下的2 个相同的膜曝气生物反应器进行水处理,其中一个实验装置加入筛选菌株运行(增强型反应器),而另一个实验装置不加筛选菌株(平行反应器),作为平行实验装置。
反应器示意如图1。反应器装置为圆柱形,膜组件置于反应器中央,呈倒伞型。反应器容积为5 L。膜组件为聚丙烯疏水性膜,有效面积为0. 2 m2 ,平均外径为0. 5 mm,壁厚50 um,截留分子量为10 万道尔顿。供气压力为7. 0 kPa。进水由蠕动泵从废水池中抽出后,注入反应器中,反应器中的混合液经曝气膜上生物膜处理后自流出水。
2 组反应器构造相同,不同点是膜曝气组件膜面生物膜微生物组分不同。2 组反应器平行运行。加入所筛菌株的反应器简称为增强型反应器,不加所筛菌株反应器成为平行反应器。
1. 2. 2 挂膜
2 组反应器均采用间歇曝气的运行方式进行挂膜,平行反应器接种污泥为西安市第四污水处理厂A2 /O 中曝气池中活性污泥与曝气沉砂池出水(表1)的混合液(体积比1 ∶ 1)(其中活性污泥投加量为4 g·L - 1 )。增强型反应器接种污泥为西安市第四污水处理厂A2 / O 中曝气池中活性污泥、筛菌菌悬液(富集培养基培养)、曝气沉砂池出水(表1) 的混合液(体积比1 ∶ 1 ∶ 1) (其中活性污泥、筛菌菌悬液投加量均为2 g·L - 1 )。
将混合液以悬浮态分别加入到各自反应器中,循环24 h 后排空,重新加入混合液后继续进行循环,一周后观察到膜上有黄褐色生物膜形成,于是开始连续进水并逐渐加大进水负荷,15 d 后膜面黄褐色生物膜加厚并布满膜面,认为挂膜成功。
1. 3 实验用水
实验用水采用西安市第四污水厂曝气沉砂池出水,水质情况如表1 所示。
表1 废水水质情况
1. 4 水质测定方法
COD、氨氮和总氮等测定方法均参考《水和废水监测方法》第4 版。其中COD 测定方法为重铬酸钾法(P210-213);氨氮测定方法为纳氏试剂光度法(P276-281);总氮测定方法为过硫酸钾氧化紫外分光光度法(P254-257)。测定数据均做平行实验,取均值。
1. 5 变性梯度凝胶电泳( DGGE)
取1 000 μL 的生物膜样品(超声震荡30 min),进行1. 1. 5 的步骤,完成后取PCR 扩增产物80 μL 在JY-TD331 型DGGE 电泳仪中进行分离。其中,聚丙烯酰胺浓度为8% ,凝胶厚度0. 75 mm。凝胶变性梯度采用30% ~ 70% 。电泳缓冲液为1 × TAE(三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸),电泳温度60 ℃,电压150 V,电泳时间7. 5 h。电泳完成后,采用溴化乙锭(EB)染色法染色20 min,之后在紫外灯下观察拍照。
2 运行结果与讨论
2. 1 菌种鉴定
经过复筛后,一株脱氮率在90% 以上的菌株被筛选出来。图2 为菌株的扫描电镜图片,为短杆状。菌株为革兰氏染色阴性菌。
图3 给出了菌株DNA 经PCR 扩增后的琼脂糖电泳,从图中可以看出,阴性对照良好。PCR 扩增序列可以进行测序,经上海生工公司测序后,结果输入NCBI 数据库比对可初步鉴定为假单胞菌Pseudomonassp. 菌属(表2)。
表2 菌株测序结果
2. 2 污染物处理效果
根据汪舒怡等的研究结果,采用水力停留时间为5 h,运行负荷为7. 6 g COD·(m2 ·d) - 1 。由于处理的水样及选取的污泥均取自同一污水厂,因此本研究未进行污泥驯化,挂膜后直接进入污染物去除阶段,主要考察平行反应器对污水的去除效果。图4 为运行期污染物去除的效果。
从图4(a)中可以看出,2 组反应器COD 的去除效率均较高,COD 的去除率基本稳定在85% 以上,增强型反应器中比平行反应器的COD 的去除率高出约2% ~ 3% ,说明所筛菌株反硝化时消耗了一定的碳源。
图4(b)显示了氨氮随时间的运行结果,氨氮去除率可达到90% 以上,氨氮去除率在两种反应器中也较为接近,这说明膜曝气生物反应器工艺对氨氮有较好的去除。
图4(c)为总氮的去除情况,2 组反应器对总氮的去除也很好,显示了膜曝气生物反应器工艺脱氮性能的优越性。从运行开始,增强型反应器比平行反应器的要高出5% 左右,随着运行时间的增加,总氮有了更好的去除,增强型反应器比平行反应器脱氮率高出10% 左右,总氮去除率达到85% ,这说明筛菌微生物起到了很好的脱氮作用。
2. 3 膜面微生物变化
为了更好地了解膜面微生物的组分,对运行后期膜曝气上生物膜进行了变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。之后割胶,再按1. 1. 5 的方法测序,得到结果如图5 及表3 所示。从图5 可以看出,2 组反应器的膜面生物多样性较好,条带比对显示,微生物种类基本一致,仅仅在亮度上有所不同,尤其是条带6,可以看出,增强型反应器比平行反应器增多,应该为所筛菌株。经测序后的结果表3 中可以证实。从微观上证明了所筛菌种发挥了重要作用。
表3 DGGE 图谱中分离出条带测序结果
从表3 中可以看出,条带中表现出的菌株为Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas sp. 亚硝化单胞菌属,Nitrosospira 亚硝化螺菌属,其余则为污染物降解菌,如变形杆菌属( Uncultured beta proteobacteriumBa1. 0, Uncultured beta proteobacterium Ch6S)。
2. 4 纯菌株独立挂膜研究
为了进一步对筛选的菌株独立挂膜,考察是否该菌株确有好氧反硝化的作用,本研究在传统反应器基础上仅添加所筛选菌株构建独立挂膜反应器,并同时再次运行平行实验装置,3 组进行对比研究。挂膜方式及运行与1. 2. 2 及2. 2 相同。经运行30 d后发现,与2. 2 污染物去除结果相类似,3 组反应器COD 的去除效率均较高,COD 去除率基本稳定在85% 以上,相差不大。氨氮随时间的运行结果,氨氮去除率可达到90% 以上,氨氮去除率在3 种反应器中也较为接近。独立挂膜反应器与增强型反应器对总氮的去除率分别达到85% 和84% ,而平行反应器对总氮的去除率为73% 。从图4 看出,增强型反应器与平行反应器对总氮的去除率分别达到85% 和75% 。因此,重复实验与前期实验无显著性差异。
研究认为:独立挂膜反应器脱氮效果良好,但是污染去除效果与增强型反应器相差不大,从经济角度和生物多样性角度认为增强型反应器更适合于污水处理。具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。
3 结论
1)筛选一株好氧反硝化菌,其脱氮效率为90% 以上,经鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp. 。
2)将菌株添加到膜曝气生物反应器构建高效脱氮菌群增强膜曝气生物反应器来处理市政污水。研究表明,对于高效脱氮菌的附着下形成的增强型膜曝气生物反应器,在COD 负荷为7. 6 g COD·(m2 ·d) - 1 ,水力停留时间为5 h 下,可使污染物的COD,氨氮及总氮的去除率分别保持在87% 、98% 和85%以上。
3)DGGE 分析显示,2 组反应器的膜面生物多样性较好。测序结果表明,筛选菌种在增强型膜曝气生物反应器中比平行膜曝气生物反应器明显增多,从微观上证明了菌种发挥了重要作用。