申请日20200425
公开(公告)日20200728
IPC分类号C12N11/10; C12N9/00; C12N1/20; C12N1/02; C02F3/34
摘要
本发明公开了一种用于污水脱氮的固定化酶及其制备方法和应用，涉及污水处理的技术领域，其固定化酶的制备方法，包括以下步骤：S1准备硝化细菌和反硝化细菌菌体备用;S2将菌体超声破碎后离心，得到粗酶提取液;S3在粗酶溶液中加入活性炭混合吸附;S4酶的固定化：将富集的酶液加入含有聚乙烯醇、海藻酸钠的载体溶液，随后将混合液逐滴滴入含2%无水CaCl2的硼酸饱和溶液中，静置后获得固定化小球，用去离子水清洗后制得固定化脱氮酶。该固定化酶可用于去除污水中氨氮，具有制备方法简单、可重复利用、生产成本低等优点。
权利要求书
1.一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1准备硝化细菌和反硝化细菌菌体备用;
S2粗酶提取液的获取：取步骤S1中的菌体重悬液，采用超声破碎细胞后，离心，上清液即为酶粗提液;
S3酶的富集：在上述的酶粗提液中加入活性炭，混合吸附后得到混合液A;
S4酶的固定化：将所述混合液A加入载体溶液，混合后得到混合液B，再将所述混合液B滴入交联剂溶液中，在4℃下固定化交联12~36 h后，用去离子水清洗，制得固定化脱氮酶;所述载体溶液为聚乙烯醇和海藻酸钠混合液,所述聚乙烯醇的质量分数为5%~15%，所述海藻酸钠的质量分数为0~2%。
2.根据权利要求1所述的一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中超声破碎的条件为：机间歇处理30~99次，每次3~5 s，中间间隔3~5 s，破碎功率175~225 W。
3.根据权利要求1所述的一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的离心采用高速冷冻离心，所述离心条件为：在35000~45000 xg下离心25~35 min。
4.根据权利要求1 所述的一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中活性炭的投加量为粗酶提取液质量的2%~6%，吸附时间为7.5~12.5 min。
5.根据权利要求1所述的一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的交联剂为饱和硼酸溶液，所述饱和硼酸溶液内添加有质量分数为2%的无水CaCl2，所述饱和硼酸溶液的pH预先调至6.5~7.0。
6.根据权利要求1所述的一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述混合液A和所述载体溶液的混合质量比为1:1~5。
7.根据权利要求1所述的一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述硝化细菌和反硝化细菌的获得包括以下步骤：
S1-1取污水厂处理中的污泥分别接种到硝化细菌和反硝化细菌培养基中进行菌株培养;S1-2将上述的培养液分别离心分离，弃去上清液后获得浓缩的硝化细菌和反硝化细菌的菌体;S1-3将得到的硝化细菌和反硝化细菌的菌体合并后，再加入缓冲液将浓缩的菌体重悬，如此清洗多次，获得菌体重悬液备用。
8.根据权利要求1所述的一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其特征在于，将接种至所述硝化菌培养基的样品在pH为7.0~8.0的条件下培养25~35天;将接种至所述反硝化菌培养基的样品在溶解氧低于0.5 mg/L、pH为6.5~7.5以及25~35℃的培养温度下培养7~15天。
9.一种用于污水脱氮的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶采用权利要求1-8任一所述的方法制备得到。
10.一种权利要求9所述的用于污水脱氮的固定化酶的应用。
说明书
一种用于污水脱氮的固定化酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及污水处理的技术领域，更具体地说，它涉及一种用于污水脱氮的固定化酶及其制备方法和应用。
背景技术
目前地表水污染的一个主要的因素是水体内的总氮含量过高(总氮包括氨氮和硝态氮)，其带来的一个结果是导致水体富营养化，水体内绿藻生长量变多，水中溶氧量少，不利于水生动植物的生长。其次，水体中的氨态氮(NH3)过高不仅阻止生物体内的氨向体外排出，还能从水中向其体内渗透，使水生生物代谢减少或停滞，损害包括鳃在内的一些重要器官，抑制其生长发育，甚至造成死亡因而现有的研究中，对于污水脱氮的处理方法之一在于：采用消化细菌和反硝化细菌相结合的方式进行污水中氨氮、硝态氮的脱除。
申请号为2019103687780的发明专利公开了一种短程反硝化—污泥发酵耦合厌氧氨氧化系统处理生活污水的装置和方法，其方法中结合硝化细菌和反硝化细菌的作用进行生活污水中总氮的脱除。授权公告号为105084682的发明专利公开了一种提高废水中氨氮处理效率的方法，其方法中也是利用硝化细菌进行相关的废水处理。采用上述的方法进行废水处理的过程中，虽然其废水处理过程中，对于硝态氮或者氨氮的脱除效率较高，但是同时也存在水处理时间较长的问题，一般其废水处理合格的时间为3天以上。这一点造成了废水处理的效率较低。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，其具有通过菌体培养、细胞破碎和细胞内酶的提取以及酶的固定化之后得到脱氮效率高的固定化酶。
本发明的第二个目的在于提供一种用于污水脱氮的固定化酶，其具有在短时间内高效进行污水脱氮的优点。
本发明的第三个目的在于提供一种用于污水脱氮的固定化酶的应用，其具有简单地应用于污水脱氮以及脱氮效率高、周期短的优点。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于污水脱氮的固定化酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1准备硝化细菌和反硝化细菌菌体备用;
S2粗酶提取液的获取：于步骤S1中的菌体重悬液，采用超声破碎细胞后，离心，上清液即为酶粗提液;
S3酶的富集：在上述的酶粗提液中加入活性炭，混合吸附后得到混合液A;
S4酶的固定化：将所述混合液A加入载体溶液，混合后得到混合液B，再将所述混合液B滴入交联剂中，在4℃下固定化交联12～36h后，用去离子水清洗，制得固定化脱氮酶;所述载体溶液为聚乙烯醇和海藻酸钠混合液,所述聚乙烯醇的质量分数为5%～15%，所述海藻酸钠的质量分数为0～2%。
通过采用上述技术方案，通过将得到的硝化细菌菌体和反硝化细菌菌体进行超声破碎的方式得到细胞内的硝化作用的酶和反硝化作用的酶，随后进行酶的固定化，得到具有较佳脱氮效果的固定化酶。首先，采用超声破碎的方式获得细胞内的包含硝化作用的酶或者反硝化作用的酶的粗酶提取液，超声破碎的方式在工业化可实施，且超声破碎的方式对酶的结构破坏较小，使得采用超声法进行细胞破碎之后，细胞内的活性物质依然具有较好的活性。随后将粗酶提取液经过活性炭吸附之后，获得纯度较高的酶提取液，采用较为温和有效的方式对酶进行纯化处理。最后对目标的硝化作用的酶和反硝化作用的酶进行进一步地固定化之后以获取更高、更为稳定的酶活性，从而最终获得更好的污水脱氮效果，其污水脱氨氮的效率高、氨氮脱除率高。
进一步地，所述步骤S2中超声破碎的条件为：机间歇处理30～99次，每次3～5s，中间间隔3～5s，破碎功率175～225W。
通过采用上述技术方案，在上述的细胞破碎方式下，得到的固定化酶的脱氮效果更好。上述的操作参数对具有脱氮效果的酶混合物的结构破坏较小，使得具有脱氮效果的酶混合物具有较高的生物活性，进而在将具有脱氮效果的酶混合物用于污水脱氮的时候具有较好的脱氮效果。
进一步地，所述步骤S2的离心采用高速冷冻离心，所述离心条件为：在35000～45000xg下离心25～35min。
通过采用上述技术方案，在上述的离心条件下浓缩得到的具有脱氮效果的酶混合物的含量更高，使得最终具有脱氮效果的酶混合物具有更好的污水脱氮效果。
进一步地，所述步骤S3中活性炭的投加量为粗酶提取液质量的2%～6%，吸附时间为7.5～12.5min。
通过采用上述技术方案，在上述的活性炭用量以及吸附时间下，将粗酶提取液中的杂质物质进一步去除，剩下的物质中，具有脱氮效果的酶混合物的质量百分比更高，因此提纯后的具有脱氮效果的酶混合物中，实际具有脱氮效果的生物活性物质的含量更高，最终使得固定化酶的最终脱氮效果更佳。
进一步地，所述步骤S4中的交联剂为饱和硼酸溶液，所述饱和硼酸溶液内添加有质量分数为2%的无水CaCl2，所述饱和硼酸溶液的pH预先调至6.5～7.0。
通过采用上述技术方案，使用上述交联剂制得的凝胶颗粒机械强度高，使用寿命长且弹性好。
进一步地，所述步骤S4中，所述混合液A和所述载体溶液的混合质量比为1:1～5。
通过采用上述技术方案，单位载体上可以固定足够多的目标酶且能保障优良的传质性能状态。
进一步地，所述硝化细菌和反硝化细菌的获得包括以下步骤：
S1-1去污水厂处理中的污泥分别接种到硝化细菌和反硝化细菌培养基中进行菌株培养;S1-2将上述的培养液分别离心分离，弃去上清液后获得浓缩的硝化细菌和反硝化细菌的菌体;S1-3将得到的硝化细菌和反硝化细菌的菌体合并后，再加入缓冲液将浓缩的菌体重悬，如此清洗多次，获得菌体重悬液备用。
通过采用上述技术方案，可获得富集的浓度较高的硝化菌液和反硝化菌液。
进一步地，将接种至所述硝化菌培养基的样品在pH为7.0～8.0的条件下培养25～35天;将接种至所述反硝化菌培养基的样品在溶解氧低于0.5mg/L、pH为6.5～7.5以及25～35℃的培养温度下培养7～15天。
为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于污水脱氮的固定化酶，所述固定化酶采用上述的方法制备得到。
通过采用上述技术方案，制备得到的固定化酶的机械强度高，使用寿命长。
为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：上述的一种用于污水脱氮的固定化酶的应用。
通过采用上述技术方案，应用方法简单，脱氨氮效率较高。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、由于本发明采用细胞破碎后进行胞内提取物的除杂和酶的固定化操作，进而获得脱除氨氮效率高的固定化酶。
第二、本发明中优选采用超声破碎的方式将硝化细菌和反硝化细菌破碎之后，获得较好的细胞破碎结果，使得胞内的提取物被释放出来，进而为后续获得更多的具有脱氮效果的活性物质提供基础，使得最后得到的固定化酶的脱氮效率更高。（发明人朱琳琳;汪翠萍;郑淑文;张阳阳;秦梓耕;王战台;潘建通;陈凯华;迟金宝）