申请日2017.12.12
公开(公告)日2018.07.06
IPC分类号C12N1/02; C12N1/20; C12Q1/04; C12R1/01
摘要
本发明提供了一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法。根据胞外产电菌可将柠檬酸铁中Fe3+还原成Fe这一原理，通过柠檬酸铁固体培养基分离、纯化厌氧活性污泥中的厌氧菌，并根据菌落周围培养基变黑范围的大小初步选定出一些高产电能力胞外产电菌，再通过循环伏安法对初步选定的高产电能力胞外产电菌进行测定和对比，最终筛选出最优高产电能力胞外产电菌，为后续的产电菌的诱导驯化奠定基础。该方法简单易行，可以高效准确的筛选出厌氧活性污泥中的高产电能力胞外产电菌。
权利要求书
1.一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，包括步骤：
S1：在LB液体培养基中富集厌氧活性污泥中的厌氧菌;
S2：稀释所述厌氧菌的菌液并将所述菌液涂布于柠檬酸铁固体培养基上;
S3：查看所述柠檬酸铁固体培养基上是否有使所述柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落，若无则重复所述步骤S1和S2，若有则通过平板划线法对使所述柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落进行纯化得到纯菌株;
S4：重复所述步骤S3获得一个以上所述纯菌株，在同等条件下对比各所述纯菌株使所述柠檬酸铁固体培养基变黑范围的大小，使所述柠檬酸铁固体培养基变黑范围最大的所述纯菌株为初步选定的高产电能力胞外产电菌;
S5：重复所述步骤S4获得一个以上所述初步选定的高产电能力胞外产电菌，
S6：在同等条件下通过循环伏安法测定所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，对比所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，所述电化学活性最高的菌株为最优高产电能力胞外产电菌。
2.根据权利要求1所述的一种在活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，所述柠檬酸铁固体培养基的配方为：
胰蛋白胨：10g/L
酵母提取物：5g/L,
氯化钠：10g/L
柠檬酸铁：20mmol/L
琼脂粉：18g/L
NaOH调节pH=7±0.3。
3.根据权利要求1所述的一种在活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，所述步骤S1至S5均在厌氧工作站内进行，所述厌氧工作站内温度为30℃。
4.根据权利要求1所述的一种在活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，所述步骤S6中的所述循环伏安法为三电极循环伏安法，所述三电极为玻碳电极、钛电极、Ag/AgCl电极，所述玻碳电极作为工作电极，所述钛电极为对电极，所述Ag/AgCl电极作为参比电极。
5.根据权利要求1所述的一种在活性污泥 中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，所述步骤S6具体包括：
S61：通过所述三电极循环伏安法对无菌LB液体培养基进行测定获得曲线1;
S62：通过所述三电极循环伏安法对接种所述初步选定的高产电能力胞外产电菌进行测定获得曲线2;
S63：对比所述曲线1和所述曲线2，获得所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的还原峰;
S64：重复所述步骤S61、S62和S63获得一个以上所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的还原峰，对比一个以上所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的还原峰，最高所述还原峰所对应的所述初步选定的高产电能力胞外产电菌为最优高产电能力胞外产电菌。
说明书
一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法
技术领域
本发明涉及胞外产电菌筛选领域，尤其涉及一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法。
背景技术
厌氧活性污泥是厌氧微生物群体及它们所依附的有机物质和无机物质的总称。厌氧活性污泥中包含丰富的厌氧微生物，适合筛选胞外产电菌。胞外产电菌具有直接将电子传递给化合物或间接电子受体的能力，多为厌氧菌或兼性厌氧菌。许多厌氧菌只能将电子传递给可溶性外源化合物，如硝酸盐或硫酸盐，它们能通过扩散作用进入细胞膜内部，胞外产电菌具有将电子传递到胞外的能力区别于其他厌氧微生物，这种能力可作用于微生物燃料电池产电。胞外产电菌在电池阳极氧化有机物产生电子，通过外电路传递到阴极，与阴极的氧气、质子发生还原反应生成水，完成整个氧化还原过程产生电流。在整个产电过程中胞外产电菌作为生物催化剂起到重要作用。筛选高产电能力胞外产电菌对研究单菌对微生物燃料电池的产电影响和其电子转移机制有着重要意义。目前仅两类模式异化金属还原菌被分离纯化出来和进行了系统的研究，对其它胞外产电菌的筛选尚无简单有效的方法，而筛选出高产电能力的产电菌是进行后续拓展研究的关键。专利CN201210059296公开了一种筛选产电微生物的方法，但此法筛选出的微生物并非全是产电菌，也不能很准确的筛选出产电能力较高的产电菌以便于后续的诱导驯化工作。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法。在厌氧条件下，富集厌氧活性污泥中的厌氧菌。将厌氧菌的菌液稀释并涂布在柠檬酸铁固体培养基上;根据胞外产电菌可将柠檬酸铁中Fe3+还原成Fe这一原理，查看是否有使柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落，使柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落进行纯化得到纯菌株。对比各纯菌株使柠檬酸铁固体培养基变黑范围的大小，变黑范围最大的初步选定为高产电能力胞外产电菌。通过循环伏安法测定并对比多个初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，电化学活性最高的菌株为最优高产电能力胞外产电菌。
本发明的技术方案如下：
一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，包括步骤：
S1：在LB液体培养基中富集厌氧活性污泥中的厌氧菌;
S2：稀释厌氧菌的菌液并将菌液涂布于柠檬酸铁固体培养基上;
S3：查看柠檬酸铁固体培养基上是否有使培养基由褐色变为黑色的单菌落，若无则重复步骤S1和S2，若有则通过平板划线法对使培养基由褐色变黑的单菌落进行纯化得到纯菌株;
S4：重复步骤S3获得一个以上纯菌株，在同等条件下对比各纯菌株使柠檬酸铁固体培养基变黑范围的大小，变黑范围最大的纯菌株初步选定为高产电能力胞外产电菌;
S5：重复步骤S4获得一个以上初步选定的高产电能力胞外产电菌;
S6：在同等条件下通过循环伏安法测定并对比各个初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，电化学活性最高的菌株为最优高产电能力胞外产电菌。
优选的，柠檬酸铁固体培养基的配方为：
胰蛋白胨：10g/L
酵母提取物：5g/L,
氯化钠：10g/L
柠檬酸铁：20mmol/L
琼脂粉：18g/L
用NaOH调节pH=7±0.3
优选的，步骤S1至S5均在厌氧工作站内的厌氧条件下进行，厌氧工作站内温度保持在30℃。
优选的，循环伏安法为三电极循环伏安法，玻碳电极作为工作电极，钛电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极。
优选的，步骤S6具体包括：
S61：通过三电极循环伏安法对无菌LB液体培养基进行测定获得曲线1;
S62：通过三电极循环伏安法对接种初步选定的高产电能力胞外产电菌进行测定获得曲线2;
S63：对比曲线1和所述曲线2，获得初步选定的高产电能力胞外产电菌的还原峰;
S64：重复步骤S61、S62和S63获得多个初步选定的高产电能力胞外产电菌的还原峰，对比对比各还原峰，还原峰最高的为最优高产电能力胞外产电菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本方法提供的一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，根据胞外产电菌可将柠檬酸铁中Fe3+还原成Fe这一原理，通过柠檬酸铁固体培养基分离、纯化厌氧污泥中的厌氧菌，并根据菌落周围培养基变黑范围的大小初步选定若干高产电能力胞外产电菌，再通过循环伏安法对初步筛选出的高产电能力胞外产电菌逐一进行测定和对比，从而筛选出一批产电能力比较高的胞外产电菌，为后续的诱导驯化做好准备，该方法简单易行，可以高效准确筛选出厌氧活性污泥中的高产电能力胞外产电菌。