申请日2019.01.10
公开(公告)日2019.03.12
IPC分类号C02F3/34; C02F3/12; C02F103/20; C02F101/30; C02F101/16; C02F101/20; C02F101/10
摘要
本发明公开了一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，技术流程包括：(1)微生物发酵液的制备;(2)固定化微生物的制备;(3)固定化微生物诱导培养;(4)驯化培养;(5)养殖废水处理。本发明构建出多种微生物共生体系，这些微生物能够协同作用，有效降解畜禽养殖废水中的有机物、氮、磷以及重金属污染物;采用复合包埋材料对微生物进行固定，形成独特的微环境对外界侵害产生良好的屏蔽作用，通过诱导培养、驯化培养进一步提高固定化微生物对养殖废水的抵抗性和耐受性，应用于废水处理系统，使用周期内稳定性较高且对畜禽养殖废水有良好的降解效果，为固定化微生物在废水处理中的实际应用奠定了基础。
权利要求书
1.一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：
(1)微生物发酵液的制备：将粪产碱杆菌、施氏假单胞菌、凝结芽孢杆菌、皮特不动杆菌和产黄青霉的种子液按照3:3:2:2:5的比例混合，然后将混合种子液接入发酵培养基中，接种量为10-15%，发酵罐参数设置为装料系数50-60%，通气量0.8-1.2VVM，转速160-200r/min，温度28-32℃，发酵培养60-72h;
(2)固定化微生物的制备：微生物发酵液用转速为7500r/min的离心机离心15min收集菌体再重悬于蒸馏水中，然后与复合包埋材料以1:20的体积比充分混合，缓慢滴入饱和硼酸和3%氯化钙溶液中交联，形成固定化微生物凝胶球，放入4℃冰箱中固定24h，取出凝胶球用9%NaCl 溶液清洗后，再用蒸馏水洗涤2-3次备用;
(3)固定化微生物诱导培养：把制备好的固定化微生物凝胶球装入三颈烧瓶中，加入占烧瓶体积40%的诱导培养基，通入净化空气在温度28-32℃的条件下培养48h，在培养期间间歇性向烧瓶中通入高纯氢气;
(4)驯化培养：向驯化反应器中加入养殖废水，并加入经过诱导培养的固定化微生物凝胶球，驯化反应器曝气量设置为保持水中溶解氧含量在2.5-3.5mg/L，驯化时间为36-48h，驯化温度为28-32℃;
(5)养殖废水处理：将驯化好的固定化微生物凝胶球投入SBR间歇好氧处理系统的反应器中，投入量为反应器有效体积的20%，运行时温度设置为25-35℃，运行周期设置为12h，运行程序设置为进水30min，曝气反应8h，静置3h，出水30min，对处理后的养殖废水进行相关指标测定。
2.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，粪产碱杆菌、施氏假单胞菌和皮特不动杆菌种子液的培养方法为：采用平板涂布法将这三种微生物的菌种接种于营养琼脂培养基上，30℃恒温培养48-72h，挑取在平板上生长良好的单菌落，无菌操作条件下接种到营养肉汤培养基中，于30℃、160r/min摇床振荡培养48h。
3.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，凝结芽孢杆菌种子液的培养方法为：采用平板涂布法将凝结芽孢杆菌的菌种接种于LB固体培养基上，35℃恒温培养48-72h，挑取在平板上生长良好的单菌落，无菌操作条件下接种到LB液体培养基中，于35℃、180r/min摇床振荡培养24h。
4.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，产黄青霉种子液的培养方法为：采用平板涂布法将产黄青霉的菌种接种于PDA培养基上，28℃恒温培养4-6d，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成孢子悬浮液，按照5%的接种量接入PDB培养基中，于28℃、150r/min摇床振荡培养72h。
5.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，发酵培养基的成分为：麸皮24-30g/L，糖蜜11-15g/L，酵母粉4-6g/L，(NH4)2SO4 3-5g/L，NaCl 8.5-9.3g/L，KNO3 4.3-4.7g/L，K2HPO4 0.4-0.6g/L，KH2PO4 1.5-1.9g/L，MgSO4·7H2O1.2-1.4g/L，CaCl2 0.4-0.5g/L，CoCl2·6H2O 3.5-4.0mg/L，FeSO4·7H2O 5.2-5.6mg/L，MnSO4·H2O 1.6-2.2mg/L，余量为水，pH值自然。
6.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，包埋材料的成分为聚乙烯醇4%，海藻酸钠3%，硅藻土0.2%， Fe3O4纳米颗粒0.3%，活性炭0.2%。
7.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(3)中，诱导培养基的成分为：蔗糖12-16g/L，豆粕粉5.1-5.5g/L，尿素3.3-3.8g/L，NaCl 3.6-4.0g/L，KH2PO4 1.3-1.7g/L，MgSO4·7H2O0.7-0.8g/L，谷胱甘肽14-18mg/L，柠檬酸钠 6.5-7.5mg/L，硝普钠48-52μmol/L，甜菜碱1.6-2.0mg/L，黄腐酸0.24-0.28g/L，康多酚0.1-0.2mg/L，pH值自然。
8.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(3)中，间歇通气是指在培养的第12h、24h、36h通入高纯氢气，通气量为充满整个三颈烧瓶。
9.根据权利要求1所述的一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，所述步骤(4)中，驯化反应器应附设进料系统、曝气系统和温控系统，加入的固定化微生物凝胶球与养殖废水的体积比为1:3-1:5。
说明书
一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法
技术领域
本发明属于环保废水处理技术领域，具体涉及一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法。
背景技术
近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们对畜禽产品如肉、蛋、奶等的需求量逐渐增加，使得我国的规模化、集约化畜禽养殖业蓬勃发展，我国的畜禽生产水平也得到了很大提高，但同时也引起了严重的环境污染问题。据调查显示，畜禽养殖业排放的化学需氧量(COD)达到 1268.26万吨，占全国 COD 排放总量的41.9%，氮和磷的排放量分别为102.48万吨和16.04万吨，分别占全国氮和磷排放总量的21.7%和37.9%，畜禽养殖污染已成为继工业污染、生活垃圾污染后的第三大污染源，解决畜禽养殖污染问题已刻不容缓。
畜禽养殖主要包括猪、牛、羊、马、鸡、鸭、鹅等，畜禽养殖废水主要由畜禽粪便、尿液、栏舍冲洗水和部分生活污水组成，属于高有机物浓度、高氮、磷含量和高有害微生物数量的“三高”废水。而高密度的养殖环境为传染病的发生和流行提供了条件，一旦疫病侵入，就会传播蔓延，造成巨大的经济损失。因此，铜、锌等重金属元素及抗生素也被广泛用于畜禽养殖，虽然在预防和治疗疾病、促进动物生长以及提高饲料利用效率等方面发挥了重要作用，但也给环境带来了很多负面影响。由于重金属元素和抗生素在畜禽体内利用率较低，大部分会以原形或其代谢产物形式随畜禽粪尿一起排入水环境中，导致养殖场废水中除常规污染物外，还含有重金属、抗生素等多种污染物，对周围水体、大气、土壤造成严重污染，并且危及人体健康。畜禽养殖废水进入水体后，使水体富营养化，滋生大量的病原微生物，还会产生氨气、硫化氢等有毒气体，不仅使水体发黑变臭，还会诱发人体各种呼吸道疾病和炎症;进入土壤后，废水经分解会产生亚硝酸盐类，可能导致土壤空隙堵塞，造成土壤透气、透水性下降及板结、盐化，严重影响土壤质量和农作物生长，废水中含有的重金属元素、病原微生物、寄生虫及虫卵等会污染土壤农作物，并且通过食物链进入人体，引发疾病。
目前，畜禽养殖废水的处理方式主要包括生态化处理和工业化处理。生态化处理方式是指利用天然水体和土壤中的微生物来处理废水的方法，主要有氧化塘和人工湿地等。氧化塘主要用来降低水体的污染物含量，同时提高溶解氧的含量，并适当除去水中的氮和磷，减轻水体富营养化的程度;人工湿地可通过沉淀、吸附、阻隔、微生物同化分解、硝化、反硝化，以及植物吸收等途径除去废水中的悬浮物、有机物、重金属等杂质。生态化处理方式的优点在于前期投资小、操作简单、运行费用低，缺点是占地面积大，处理效果受季节、地理环境影响显著，停留时间长，并且如果处理不当，就会造成污染物的释放而形成新的污染。工业化处理方式是指通过人工调整运行参数维持适宜的生长环境，使得污水处理微生物大量生长繁殖，从而提高处理效果，减少水力停留时间，逐渐成为畜禽养殖废水处理的主要选择。畜禽养殖废水的工业化处理系统包括厌氧处理系统、间歇好氧处理系统、好氧处理系统这三类，但是单独采用某一种处理系统往往无法达到较好的处理效果，而采用厌氧-好氧联合处理工艺是目前公认的最经济、高效的方法。
固定化微生物技术是生物工程领域中一项新兴的技术，该技术是通过化学或物理手段，将游离的微生物固定在载体上，保持微生物的活性，使微生物在适宜条件下能够快速、大量增殖。20世纪80年代初，国内外开始了关于利用固定化微生物技术来处理工业废水和分解有机污染物的研究，并取得了显著进展。与游离微生物处理废水相比，固定化微生物处理具有更好的优势，首先固定化技术使微生物不易流失，反应更容易控制，还能够大幅度提高参加反应的微生物浓度;其次固定化微生物与反应物作用时间长，同时固定化载体对外界侵害产生良好的屏蔽作用，能提高微生物的耐受性;第三固液分离容易，二次污染少，可被多次利用。
畜禽养殖废水是一个十分复杂的混合体系，目前规模化养殖废水处理中人们主要考虑对常规污染指标如化学需氧量(COD)、生化需氧量(BOD)、总氮(TN)和总磷(TP)等的削减和控制，而极少关注养殖废水中的重金属、抗生素等其他污染物的去除。在现有的关于工业化处理养殖废水的报道中，经厌氧系统处理后能去除大部分有机物和悬浮物，但是在好氧处理过程中存在着总氮和总磷去除率不够高，处理效果不理想的问题。此外，要实现固定化微生物处理畜禽养殖废水的规模化，还需考虑固定化载体的稳定性、传质性能、机械强度、使用寿命、成本等诸多因素。
发明内容
针对现有畜禽养殖废水处理技术中存在的问题，本发明提供了一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，不仅能提高废水中有机物、总氮、总磷以及重金属污染物的降解率，还能在较长时间内保持微生物高效的降解效果，具有很高的应用价值。
本发明的技术方案概述如下：
一种固定化微生物在畜禽养殖废水处理中的应用方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：
(1)微生物发酵液的制备：将粪产碱杆菌、施氏假单胞菌、凝结芽孢杆菌、皮特不动杆菌和产黄青霉的种子液按照3:3:2:2:5的比例混合，然后将混合种子液接入发酵培养基中，接种量为10-15%，发酵罐参数设置为装料系数50-60%，通气量0.8-1.2VVM，转速160-200r/min，温度28-32℃，发酵培养60-72h;
(2)固定化微生物的制备：微生物发酵液用转速为7500r/min的离心机离心15min收集菌体再重悬于蒸馏水中，然后与复合包埋材料以1:20的体积比充分混合，缓慢滴入饱和硼酸和3%氯化钙溶液中交联，形成固定化微生物凝胶球，放入4℃冰箱中固定24h，取出凝胶球用9%NaCl 溶液清洗后，再用蒸馏水洗涤2-3次备用;
(3)固定化微生物诱导培养：把制备好的固定化微生物凝胶球装入三颈烧瓶中，加入占烧瓶体积40%的诱导培养基，通入净化空气在温度28-32℃的条件下培养48h，在培养期间间歇性向烧瓶中通入高纯氢气;
(4)驯化培养：向驯化反应器中加入养殖废水，并加入经过诱导培养的固定化微生物凝胶球，驯化反应器曝气量设置为保持水中溶解氧含量在2.5-3.5mg/L，驯化时间为36-48h，驯化温度为28-32℃;
(5)养殖废水处理：将驯化好的固定化微生物凝胶球投入SBR间歇好氧处理系统的反应器中，投入量为反应器有效体积的20%，运行时温度设置为25-35℃，运行周期设置为12h，运行程序设置为进水30min，曝气反应8h，静置3h，出水30min，对处理后的养殖废水进行相关指标测定。
所述步骤(1)中，粪产碱杆菌、施氏假单胞菌和皮特不动杆菌种子液的培养方法为：采用平板涂布法将这三种微生物的菌种接种于营养琼脂培养基上，30℃恒温培养48-72h，挑取在平板上生长良好的单菌落，无菌操作条件下接种到营养肉汤培养基中，于30℃、160r/min摇床振荡培养48h。
所述步骤(1)中，凝结芽孢杆菌种子液的培养方法为：采用平板涂布法将凝结芽孢杆菌的菌种接种于LB固体培养基上，35℃恒温培养48-72h，挑取在平板上生长良好的单菌落，无菌操作条件下接种到LB液体培养基中，于35℃、180r/min摇床振荡培养24h。
所述步骤(1)中，产黄青霉种子液的培养方法为：采用平板涂布法将产黄青霉的菌种接种于PDA培养基上，28℃恒温培养4-6d，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡均匀，形成孢子悬浮液，按照5%的接种量接入PDB培养基中，于28℃、150r/min摇床振荡培养72h。
所述步骤(1)中，发酵培养基的成分为：麸皮24-30g/L，糖蜜11-15g/L，酵母粉4-6g/L，(NH4)2SO4 3-5g/L，NaCl 8.5-9.3g/L，KNO3 4.3-4.7g/L，K2HPO4 0.4-0.6g/L，KH2PO4 1.5-1.9g/L，MgSO4·7H2O1.2-1.4g/L，CaCl2 0.4-0.5g/L，CoCl2·6H2O 3.5-4.0mg/L，FeSO4·7H2O 5.2-5.6mg/L，MnSO4·H2O 1.6-2.2mg/L，余量为水，pH值自然。
所述步骤(2)中，包埋材料的成分为聚乙烯醇4%，海藻酸钠3%，硅藻土0.2%， Fe3O4纳米颗粒0.3%，活性炭0.2%。
所述步骤(3)中，诱导培养基的成分为：蔗糖12-16g/L，豆粕粉5.1-5.5g/L，尿素3.3-3.8g/L，NaCl 3.6-4.0g/L，KH2PO4 1.3-1.7g/L，MgSO4·7H2O0.7-0.8g/L，谷胱甘肽14-18mg/L，柠檬酸钠 6.5-7.5mg/L，硝普钠48-52μmol/L，甜菜碱1.6-2.0mg/L，黄腐酸0.24-0.28g/L，康多酚0.1-0.2mg/L，pH值自然。
所述步骤(3)中，间歇通气是指在培养的第12h、24h、36h通入高纯氢气，通气量为充满整个三颈烧瓶。
所述步骤(4)中，驯化反应器应附设进料系统、曝气系统和温控系统，加入的固定化微生物凝胶球与养殖废水的体积比为1:3-1:5。
本发明产生的有益效果主要包括以下几个方面：
1)本发明根据不同微生物降解效率以及降解底物的差异构建出多种微生物共生体系，粪产碱杆菌、施氏假单胞菌、凝结芽胞杆菌能够有效降解废水中的有机物和含氮污染物，皮特不动杆菌能够有效降解废水中的含磷污染物，产黄青霉本身就对重金属离子具有耐受性和抵抗性，并且可以吸附溶解废水中的重金属，这些微生物能够分工协作，互利共生，从而实现对畜禽养殖废水的有效降解。
2)本发明采用复合包埋材料对微生物进行固定，聚乙烯醇和海藻酸钠作为载体，硅藻土、豆粕粉、Fe3O4纳米颗粒、活性炭作为添加剂，硼酸和氯化钙作为交联剂，在合适的配比下制备出固定化微生物凝胶球，具有性能稳定、强度高、寿命长、传质阻力小的优点，形成的微环境对外界侵害具有良好的屏蔽作用，能提高微生物对环境的耐受性。
3)本发明通过固定化微生物诱导培养和驯化培养进一步提高固定化微生物对养殖废水的抵抗性和耐受性，诱导培养阶段通入氢气并结合特定的诱导培养基，均可以增强微生物抗氧化能力，提高微生物抗逆性，驯化培养阶段使微生物逐渐适应了废水环境，微生物生长达到较好的状态，从而使微生物具有更好的降解性能。
4)本发明在SBR间歇好氧处理系统的反应器中投入固定化微生物，大大提高了畜禽养殖废水中有机物、总氮、总磷以及重金属污染物的降解率，达到了良好的废水降解效果。固定化微生物在使用周期内稳定性较高，还可以多次利用，从而提高处理效率，降低处理成本。