申请日2018.09.15
公开(公告)日2018.12.28
IPC分类号C12P39/00; C12P7/62; C02F3/34; C12R1/01; C12R1/07; C12R1/185; C12R1/645; C12R1/38
摘要
本发明涉及一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3‑羟基丁酸酯/3‑羟基戊酸酯共聚物(PHBV)的方法，所述方法包含以下步骤：(1)将木质生物资源以水热预处理法水解酶解。(2)以水解酶解产物为碳源，通过好氧动态供料法对含活性污泥的污水进行驯化，富集可合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的细菌。(3)通过不均衡营养环境的控制积累PHA，提高PHA的产量。最终确定积累的PHA为PHBV。通过比较各实验组细胞干重和PHBV产量的数据可以获取最优培养条件。驯化后的活性污泥经过9个积累周期，生产的PHBV为303.7‑1084.4mg/，其中PHB%为40.45‑69.14%，PHV%为30.86‑59.55%。最终，确定在pH值7，总糖浓度为1700mg/，无机盐成分与氧气充足的条件下PHBV的产量达到最大值。
权利要求书
1.一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)水热预处理水解酶解木粉：
将40-80目木粉和超纯水以1:4比例加入高温高压反应釜，反应温度为180-210℃，反应时间为30-60分，得到木粉水解液，冷却;
将冷却后的木粉水解液加超纯水至1L，并调节pH至4.8，加3ml酶解液，放在磁力搅拌器中搅拌，酶解温度为30-60℃，酶解时间为24h-96h，搅拌完成后放入90℃的水浴中加热20分钟，拿出冷却后抽滤，所得滤液测总糖后放入4℃冰箱储存;
2)对污水中能合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的混合菌群进行驯化富集：
将污水投加在烧杯中进行驯化培养，驯化周期的运行方式为：进水→曝气+搅拌→沉淀→出水，运行周期为12h;
进水为木粉水解液，水的碳源浓度为500mg/L，加入的氮源浓度为40mg/L，磷源浓度为8mg/L，配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h，沉淀结束后排出250ml上清液;
3)积累PHA：
在烧杯中投加驯化后污水，污水 的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L，培养积累PHA周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水，运行周期为12h;
进水为木粉水解液，水的碳源浓度为800-1700mg/L，加入的氮源浓度为20-40mg/L，磷源浓度为4-8mg/L，配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
运行周期中沉淀段为1h，沉淀结束后排出250ml上清液。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中木粉来源包括工农业的木质废弃物粉碎过筛获得、加工剩余、废木屑、秸秆、蔗渣。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中木粉水解液的成分包括：葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤2)污水中的菌群包括动胶菌属、芽孢杆菌属、色杆菌属、诺卡氏菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、酵母菌属、放线菌属、黄色杆菌属。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中微量元素液组分及含量为40mg/LCaCl2,3mg/LFeCl3·3H2O，0.24mg/LZnSO4·7H2O，0.3mg/LCoCl2·6H2O，0.3mg/LMnCl2·4H2O，0.3mg/LH3BO3，0.06mg/LCuSO4·5H2O，0.06mg/LKI。
6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中氮源包含但不限于NH4Cl，磷源包含但不限于KH2PO4。
7.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中积累PHA是在生长限制的条件下完成的，其中生长限制通过限制至少一种营养物来实现，所述至少一种营养物选自P、N、O、K、Mg、Fe或其组合。
8.根据权利要求7中所述的方法，其特征在于，限制营养优选为N和P,其中C:N:P=100:(2-10)：(0.4-1.6)。
9.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中木粉水解液的pH值为7左右，通入的氧气含量充足。
10.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中调节加入反应器中的碳源浓度，可以调节PHBV中PHB和PHV的比例，其中PHB/PHV为0.9-2.4。
说明书
一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法
技术领域
本发明属于生物质资源高效高值利用、可生物降解塑料和固体废弃物处理领域，涉及一种利用木质碳源驯化污水混合菌种合成PHBV的方法，具体涉及一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)的方法。
背景技术
近年来，随着石油工业的发展，化学合成塑料越来越多的应用到人们的生活中，产生了很多不可降解的塑料废弃物，形成白色污染，导致很多严重的问题。因此人们致力于寻找一种可以替代石油基塑料的产品。PHBV是一种环境友好型高分子生物塑料，与传统的以石油为原料合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯等有相似的材料学性质，能完美代替传统的石油化工产品。PHBV的化学结构单元主要有3-羟基丁酸酯(3HB)和3-羟基戊酸酯(3HV)，其中3HV的含量决定了其结晶性能，晶体结构与晶体行为与共聚物的力学性能、热性能等有关。共聚物中PHV的摩尔含量为0-37%时，PHBV以PHB晶胞结构结晶;当共聚物中PHV的摩尔含量为53-95%时，则以PHV晶胞结构结晶;当PHV的摩尔含量为40mol%左右时，两种晶胞结构同时存在;PHV含量从0-95%变化时，PHBV的结晶度均高于50%。所以调节共聚物中PHV含量，可以得到性能不同的PHBV，使其能适用于更多的领域。PHBV还具有生物相容性好、降解速率快、具有光学活性、压电性、对人体无毒无害等优点。但目前PHBV的合成工艺主要是纯菌种法，纯菌种的生产原料主要是葡萄糖、丙酸等昂贵的有机碳源，生产工艺要求灭菌消毒，保证发酵过程中没有杂菌存在，这使得PHBV的生产成本很高，大大的阻碍了PHBV的工业化生产。
木质生物质资源来源广泛，包括农业秸秆类废物(如玉米杆，小麦杆等)、林木(软木和硬木)及林产加工废物、草类等，用途广，易收集，是地球上最丰富的可再生资源。木质生物质原料的主要成分为纤维素(35%-50%)、半纤维素(20%-35%)和木质素(10%-15%)，每年植物通过光合作用合成的生物质干重有1440-1800亿吨，是宝贵的生物质潜在能源。但是，我国木质生物质废弃物的回收率很低，大多数通过露天燃烧或填埋处置，这对生物质资源是一种极大的浪费。因此，合理利用木质生物质废弃物，使其具有资源化的多重效益具有很重要的意义。研究发现，木质生物质资源中的纤维素和半纤维素能水解成葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等小分子糖类，这些糖类均可以作为微生物合成PHA的底物。
利用混合菌群合成PHA也是降低PHA生产成本的一种方法。活性污泥在驯化过程中微生物的选择基于生态原理，因此菌群结构较稳定，这就为PHA的工业化生产创造了前提;混合菌种可以适应多种不同底物，从而扩大了底物的选择范围，为混合底物应用于生产打下良好基础;活性污泥合成PHA比纯菌种单底物的方法条件更温和，不需要严格的消毒纯菌环境，节省运行费用，更易于实现和操控;有利于简化PHA的工艺条件，使剩余污泥的利用成为可能。
因此，本发明利用回收的木质生物质水解产生混合的小分子糖类水解物，以混合的小分子糖类水解物为碳源喂养活性污泥混合菌群生产PHBV。本发明利用回收的木质生物质资源和活性污泥混合菌群制备PHBV，大大降低了PHBV的生产成本，具有良好的工业应用前景。同时，改变投加到反应器中的底物浓度能改变PHBV中PHB和PHV的比例，使合成的PHBV具有不同的性能，能适用于不同的领域，扩大PHBV的应用范围。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法。
本发明为解决技术背景中的问题，采用的技方案是：一种木质碳源驯化污水混合菌种合成聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物的方法，包括如下步骤：
1)水热预处理水解酶解木粉：
将40-80目木粉和超纯水以1:4比例加入高温高压反应釜，反应温度为180-210℃，反应时间为30-60分，得到木粉水解液，冷却;
将冷却后的木粉水解液加超纯水至1L，并调节pH至4.8，加3ml酶解液，放在磁力搅拌器中搅拌，酶解温度为30-60℃，酶解时间为24h-96h，搅拌完成后放入90℃的水浴中加热20分钟，拿出冷却后抽滤，所得滤液测总糖后放入4℃冰箱储存;
2)对污水中能合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的混合菌群进行驯化富集：
将污水投加在烧杯中进行驯化培养，驯化周期的运行方式为：进水→曝气+搅拌→沉淀→出水，运行周期为12h;
进水为木粉水解液，水的碳源浓度为500mg/L，加入的氮源浓度为40mg/L，磷源浓度为8mg/L，配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
在每个周期曝气段结束后排出100ml活性污泥混合液。运行周期中沉淀段为1h，沉淀结束后排出250ml上清液;
3)积累PHA：
在烧杯中投加驯化后污水，污水的初始混合液悬浮颗粒浓度(MLSS)为1500mg/L，培养积累PHA周期的运行方式为进水→曝气+搅拌→沉淀→出水，运行周期为12h;
进水为木粉水解液，水的碳源浓度为800-1700mg/L，加入的氮源浓度为20-40mg/L，磷源浓度为4-8mg/L，配水时每1L水添加100mg/L的MgSO4和1ml微量元素液;
运行周期中沉淀段为1h，沉淀结束后排出250ml上清液。
本发明所述步骤1)中木粉来源包括工农业的木质废弃物粉碎过筛获得、加工剩余、废木屑、秸秆、蔗渣。
本发明所述步骤1)中木粉水解液的成分包括：葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸。
本发明所述步骤2)污水中的菌群包括动胶菌属、芽孢杆菌属、色杆菌属、诺卡氏菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、酵母菌属、放线菌属、黄色杆菌属。
本发明所述步骤2)中微量元素液组分及含量为40mg/LCaCl2,3mg/LFeCl3·3H2O，0.24mg/LZnSO4·7H2O，0.3mg/LCoCl2·6H2O，0.3mg/LMnCl2·4H2O，0.3mg/LH3BO3，0.06mg/LCuSO4·5H2O，0.06mg/LKI。
本发明所述步骤2)中氮源包含但不限于NH4Cl，磷源包含但不限于KH2PO4。
本发明所述步骤3)中积累PHA是在生长限制的条件下完成的，其中生长限制通过限制至少一种营养物来实现，所述至少一种营养物选自P、N、O、K、Mg、Fe或其组合。
本发明限制营养优选为N和P,其中C:N:P=100:(2-10)：(0.4-1.6)。
本发明所述步骤1)中木粉水解液的pH值为7左右，通入的氧气含量充足。
积累PHA的过程中合成的聚羟基脂肪酸酯为PHBV。
本发明还包括连续监测所述微生物中生成的PHBV含量的步骤。
本发明调节加入反应器中的碳源浓度，可以调节PHBV中PHB和PHV的比例，其中PHB/PHV为0.9-2.4，生产出具有不同性能的PHBV，扩大PHBV的应用范围。
PHA组成与含量测量的具体操作步骤如下：
取8mL菌液于10mL离心管中，10000rpm离心10min，转移上清液后加入蒸馏水洗涤菌体,震荡重悬后再离心，反复两次后，放入冷冻干燥机中于-50℃条件下冷冻干燥24h，冻干后将剩余的菌体称重并记录。
PHA酯化反应液：准确称取1.0g苯甲酸(分析纯)，溶解至100mL的甲醇(色谱纯)中，再加入10mL的浓硫酸(优级纯)，超声5min至完全溶解，作为PHA检测的酯化反应液。
操作过程：称取一定量冷冻干燥后的菌体于酯化管中，加入2mL氯仿、1mL酯化反应液，于100℃反应4小时，冷却至室温后加入1mL高纯水，剧烈震荡，4℃静置。当下层有机相澄清时，即可用1mL注射针管吸取下层有机相1.0-1.5mL，转移至样品瓶内，进行高效气相色谱分析。
色谱条件：
进样口：分流/不分流进样口，温度200℃，载气N2，压力10.33psi，流量40mL/min，分流比25:1。
柱箱：程序升温，初始温度70℃，保持2min，之后以7℃/min的速度升到140℃，保持1min，再次以10℃/min的速度升高到220℃，保持1min。
检测器：FID检测器，温度250℃，H2流量40mL/min，空气流量450mL/min。积累PHA的过程中合成的聚羟基脂肪酸酯为PHBV;PHBV含量根据标品与内标在色谱图的峰面积之比计算得出。通过对不同实验组菌体生长和PHA产量的测定结果的比较分析，可以确定混合菌群的最优培养条件。
有益效果
本发明提供一种使用木质生物质水解物为碳源以混合菌群合成PHBV的方法。本发明以木质水解物为混合菌群的碳源，与以往的以淀粉、葡萄糖等为碳源合成PHA的研究相比，能够在不与人争粮的情况下降低生产PHBV的成本;以污水中的混合菌群为PHA合成菌，与纯菌种培养合成PHA相比，不需要严格的灭菌设备和无菌环境，大大降低了生产成本;污水中有多种PHAs合成菌，与单一的菌种或单一的底物合成PHA的研究比较，不同的菌能利用不同的底物，能让水解产物的的更多的物质转化为PHBV，在提高了PHBV产量的同时，降低了PHBV的生产成本。实验结果表明，木质水解酶解的最佳工艺条件为水解反应温度为200℃，反应时间为30分，酶解温度为60℃，酶解时间为48h，此时的水解产物总糖含量达到最大为13.61g/L;混合菌群积累PHA的过程中，在营养平衡的条件下，通过提高碳源浓度，可以提高PHBV的合成量，PHBV的最高合成量为为瞬时投加碳源1700mg/L 2h后，最高合成量达1084.4mg/L;在氮源或磷源缺乏的情况下，不利于PHBV的合成。