申请日2018.05.10
公开(公告)日2018.11.23
IPC分类号C12P19/04; C12R1/89
摘要
本发明公开一种利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产多糖的研究方法，主要步骤包括：1)小球藻接种;2)废水预处理;3)小球藻培养;4)多糖标准曲线绘制;5)小球藻中多糖的测定。稀释10倍后的豆腐废水最适合两株小球藻的培养，其中小球藻L166的多糖生产率高达2.86mg·L‑1·d‑1，具有同步废水利用和经济效益的生物质生产的双重作用。
翻译权利要求书
1.利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产多糖的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)小球藻接种：
(1)将小球藻L166和L38分别接种于容器内;
(2)添加BG-11培养基;
(3)接种体积为8-10.5%(V接种物/V培养基);
(4)置于光培养箱中培养7-10天：培养条件为温度22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx并通入0.5-1.0L.min-1的过滤灭菌空气条件下培养;
2)废水预处理：
(1)将豆腐废水离心、过滤并进行100-121℃高压灭菌处理;
(2)将灭菌后的豆腐废水分别稀释10倍和100倍，向12个锥形瓶中分别加入不同稀释倍数的豆腐水样200ml，每个稀释浓度设置6个样品;
3)小球藻培养：
在6个稀释10倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05;
在6个稀释100倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05;
培养条件为：温度培养条件22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx;
4)测定小球藻多糖。
2.根据权利要求1所述的利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产多糖的研究方法，其特征在于，所述步骤4)测定小球藻多糖的具体步骤如下：
(1)培养20-25天后，取各个稀释倍数豆腐废水培养条件下的小球藻样品L166和L38各20ml，转速5000rpm离心20min，弃上清液;
(2)将底部微藻固体在105℃下24h烘干，研磨成粉末状;
(3)取样品20mg，加入蒸馏水约3.0ml，在100℃下水浴2h;
(4)取上清液2.0ml，转速5000rpm离心20min，再通过真空泵中速滤纸过滤;
(5)取1.25ml滤液加入8.75ml无水乙醇于4℃下沉淀12h;
(6)将乙醇沉淀后的样品离心在转速5000rpm离心20min，舍弃上清液并将沉淀物溶于2.0ml蒸馏水中，充分摇匀;
(7)分别取1.0、0.5、0.2、0.1ml多糖水溶液稀释至1.0ml;
(8)使用移液管分别加入5%苯酚0.5ml及浓硫酸2.5ml;
(9)充分摇匀后放入100℃水浴锅中20min，冷却至室温;
(10)在490nm处进行紫外分光光度法测定，根据吸光度查找标准曲线计算多糖生产率(mg/L/d)：
3.根据权利要求1所述的利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产多糖的研究方法，其特征在于，所述步骤2)中豆腐废水原始水质：化学需氧量22.7±0.74g/L，总氮0.95±0.05mg/L，总磷0.12±0.007g/L。
说明书
利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产多糖的研究方法
技术领域
本发明涉及微藻生物处理技术领域，具体涉及一种利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产多糖的研究方法。
背景技术
我国的豆腐产量大，由豆腐生产而排放的废水量也很大。将一吨大豆加工成豆腐产生约7-10吨废水，废水的化学需氧量(COD)为8-20g/L。现如今并没有专门化的处理技术，对豆腐废水处理的研究都集中在厌氧过滤器、上流式厌氧污泥流化床等采用厌氧为主的工艺。尽管厌氧发酵处理适合于能量回收的高浓度废水的处理同时能产生沼气，但是无法去除生物氮和磷，并且需要不断调节处理过程中液体的碱度。一个最佳的处理过程应该是利用生物的生产，同时去除有机物和氮磷污染物。
豆腐废水(SPW)包含单糖、低聚糖、维生素、有机酸、氨基酸、脂类、乳清蛋白、异黄酮、皂甙、P、Ca、Fe、和其他营养物质[1-2]。豆腐废水中含有氮、磷、有机物等营养物质能被小球藻利用，它可以作为一种有效的有机废水来实现小球藻生物质生产。由于豆腐废水含有可用的营养物质且一般无有毒有害，对抑制小球藻生长作用不明显，用经适当处理的豆腐废水作为培养基可以大大提高经济效益，既利用了豆腐废水中丰富的营养物质，又促进了生物质的生产，达到了双重优化的效果。
小球藻在培养过程中积累生物质，其中多糖是一种有效的成分。多糖测定的方法主要是苯酚-硫酸法、蒽酮浓硫酸法、DDS法、碘量法等。本专利对微藻多糖的测定则采用苯酚-硫酸法，原理是多糖在浓硫酸作用下能够水解生成单糖,单糖迅速脱水生成糖醛衍生物后与苯酚缩合可生成一种橙黄色的化合物,该化合物颜色稳定且在波长490nm处有最大的吸收值,显色时间长可用比色法测定，其吸光度与总糖含量成线性关系[3]。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术存在的缺陷，提供一种利用高浓度豆腐废水培养小球藻并测定小球藻中多糖生产率的研究方法。该研究方法不仅利用及处理了豆腐废水节约培养成本同时可以获得小球藻中高价值的化学品成分多糖，实现了环境和经济的双重作用。
本发明为解决背景技术中的技术问题提出的技术方案如下：利用高浓度豆腐废水培养两株小球藻生产多糖的研究方法，包括如下步骤：
1)小球藻接种：
(1)将小球藻L166和L38分别接种于容器内;
(2)添加BG-11培养基;
(3)接种体积为8-10.5%(V接种物/V培养基);
(4)置于光培养箱中培养7-10天：培养条件为温度22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx并通入0.5-1.0L.min-1的过滤灭菌空气条件下培养;2)废水预处理：
(1)将豆腐废水离心、过滤并进行100-121℃高压灭菌处理;
(2)将灭菌后的豆腐废水分别稀释10倍和100倍，向12个锥形瓶中分别加入不同稀释倍数的豆腐水样200ml，每个稀释浓度设置6个样品;
3)小球藻培养：
在6个稀释10倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05;
在6个稀释100倍的豆腐废水样品中分别接种两种小球藻L166和L38各3瓶，控制初始吸光度为0.1±0.05;
培养条件为：温度培养条件22-25℃，白色荧光照明4000-6000Lx;
4)测定小球藻多糖。
所述步骤4)测定小球藻多糖的具体步骤如下：
(1)培养20-25天后，取各个稀释倍数豆腐废水培养条件下的小球藻样品L166和L38各20ml，转速5000rpm离心20min，弃上清液;
(2)将底部微藻固体在105℃下24h烘干，研磨成粉末状;
(3)取样品20mg，加入蒸馏水约3.0ml，在100℃下水浴2h;
(4)取上清液2.0ml，转速5000rpm离心20min，再通过真空泵中速滤纸过滤;
(5)取1.25ml滤液加入8.75ml无水乙醇于4℃下沉淀12h;
(6)将乙醇沉淀后的样品离心在转速5000rpm离心20min，舍弃上清液并将沉淀物溶于2.0ml蒸馏水中，充分摇匀;
(7)分别取1.0、0.5、0.2、0.1ml多糖水溶液稀释至1.0ml(即原液不稀释、稀释2倍、5倍和10倍);
(8)使用移液管分别加入5%苯酚0.5ml及浓硫酸2.5ml;
(9)充分摇匀后放入100℃水浴锅中20min，冷却至室温;
(10)在490nm处进行紫外分光光度法测定，根据吸光度查找标准曲线计算多糖生产率(mg/L/d)：所述步骤2)中豆腐废水原始水质：化学需氧量22.7±0.74g/L，总氮0.95±0.05mg/L，总磷0.12±0.007g/L。
与现有技术相比，本发明具有的优点：
1)本发明研究结果表明：通过20-25d的培养之后，在稀释10倍的废水中培养的L166小球藻多糖生产率最高，达2.86mg·L-1·d-1;
2)本发明将废水处理与生物质生产耦合一起，不需要额外补充营养，可以成为具有同步废水利用和具有成本效益的生物质生产的双重战略。