申请日2005.12.23
公开(公告)日2007.06.27
IPC分类号G01N21/64; C12Q1/68; C12Q1/02
摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，包括功能菌特异DNA片段的选择，微生物总DNA的提取，引物和探针的设计合成，标准曲线制定，功能菌样品的荧光定量PCR测定，功能菌含量计算、试剂盒的装配等步骤。该方法操作简单，能够快速准确检测废水中功能菌的含量。
权利要求书
1、一种快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法，包括功能菌特异 DNA片段的选择，微生物总DNA的提取，引物和探针的设计合成，标准曲 线制定，功能菌样品的荧光定量PCR测定，功能菌含量计算、试剂盒的装配 等步骤。
2、根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方 法，其特征是：所述荧光定量PCR测定是将含有功能菌特异引物和探针、耐 热DNA聚合酶、dNTP底物、待检测模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯 水等的反应体系在荧光定量PCR仪上进行反复的高温、低温、中温热循环和 荧光检测而达到目的DNA片段大量扩增和荧光信号的检测记录与分析，获得 待检测模板DNA序列的定量结果。
3、根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方 法，其特征是：所述引物和探针的设计是依据不同功能菌特异DNA序列进行 设计和合成。
4、根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方 法，其特征是：所述功能菌含量的计算是根据被测样品中功能菌个数等于被 检测靶基因拷贝数进行的。
5、根据权利要求1所述的快速测定废水处理系统中功能菌含量的方 法，其特征是：所述试剂盒是依据本发明所述功能菌特异DNA体外扩增技术， 将引物、探针、制定标准曲线用的功能菌不同稀释倍数的DNA系列模板、耐 热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水，以 及操作步骤说明书、计算公式等装配而成，用于废水处理系统功能菌的快速 检测。
说明书
一种快速测定废水处理系统中功能菌含量的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种废水处理系统中功能菌的快 速测定方法。
背景技术
废水生物处理系统中活性污泥的微生物种群组成，很大程度决定该系统 的处理效果【高平平，赵立平.TGGE分析焦化废水处理系统活性污泥细菌种 群动态变化及多样性.生态学报，2003，23(10)：1963-1969.】。研究微生物群落组 成的传统方法是以纯培养技术为基础，但此方法鉴定的微生物只占群落总数 的0.1%～10%【Torsvik V，Ovreas L.Microbial Diversity and Community Structure in Two Different Agricultural Soil Communities.Microb.Ecol， 1998，36：303-315.】，而容易培养的分离物并不总是生态学上的优势种【余利岩， 姚天爵.微生物生态学研究方法的新进展.微生物学通报，2001，28(1)：89-93.】， 造成对许多重要的微生物生态系统中种群结构认识很不全面。
近年来，一些渐为成熟的分子生物学技术在环境微生物学得到应用 【Bernard L，Courties C，Duperray C，et al.A new approach to determine the genetic diversity of viabale and active bacteria in aquatic ecosystems.Cytometry， 2001;43(4)：314-321】，如分子标记技术、凝胶电泳技术、克隆技术、原位杂 交技术等，使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物 的种群结构及其与环境的关系，弥补了传统的微生物生态学方法的不足。
但是应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)这一分子生物学方法对废水 生物处理系统中功能菌的定量检测，还未见报道。
发明内容
本发明目的在于以废水处理系统中功能菌的DNA特异片段作为检测的 靶序列，应用荧光定量聚合酶链反应体外扩增，建立一种操作简单，能够快 速、准确检测废水处理系统中功能菌含量的技术，其具体检测步骤如下：
第一步，特异DNA片段的选择。根据处理不同废水的功能菌株，选择适 合的DNA特异片段。
第二步，提取总DNA。提取废水生物处理系统中微生物的总DNA，并用 核酸测定仪测定其含量(μg/mL)。
第三步，引物和探针的设计合成。根据选定的功能菌的DNA特异序列和 引物探针设计合成原则，设计合成一对功能菌特异的引物和一条Taqman探 针。
第四步，标准曲线制定。用已知初始拷贝数的靶DNA模板按10倍梯度 进行稀释，制成标准模板系列，进行实时荧光定量PCR。将引物、探针、耐 热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等混 匀成反应体系，在定量热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环和荧 光检测，进行25-45个热循环。在此过程中，荧光定量PCR仪与含控制分析 软件的计算机连接，进行自动读取各个反应管的每个循环后的荧光值和绘制 荧光变化曲线，读取每个反应的Ct值(样品管中荧光强度增加到某一特定阈 值(threshold)时的扩增循环数)。以Ct值为纵坐标、标准模板起始拷贝数的 对数值为横坐标作图，得到该样品的标准曲线。如果其相关系数大于0.96， 则作为检测用标准曲线，对应的反应体系作为检测样品用的反应体系。
第五步，功能菌样品的荧光定量PCR测定。采用与获得标准曲线相同的 反应体系，对各个样品分别进行荧光定量PCR扩增，测定样品的Ct值。
第六步，功能菌含量计算。根据样品的Ct值和标准曲线，计算功能菌含 量。利用以下公式计算：
Nx=N0×YCto-Ctx
其中：Nx为扩增管x的靶基因的起始拷贝数，即被检测的功能菌个数。
N0为标准曲线上的一点所对应的拷贝数。
Y为扩增效率，由公式Y=101/ΔCt(ΔCt=靶DNA每稀释10倍，平 均增加的Ct值数)计算获得;相当于Ct值减少1个循环对应的 模板DNA的增加的倍数。
Ctx为扩增管x的靶基因的Ct值。
Ct0为标准曲线上靶基因拷贝数为N0时的Ct值。
废水生物处理系统中功能菌数(个/mL)=被检测靶基因拷贝数(个/mL)。
由此可以反映功能菌在废水生物处理系统中的生态地位。
第七步，试剂盒的装配。依据上述方法步骤，将引物、探针、制定标准 曲线用的功能菌不同稀释倍数的DNA系列模板、耐热DNA聚合酶、dNTP 底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水，以及操作步骤说明书、计 算公式等装配成废水处理系统功能菌检测试剂盒，可以方便应用于实际检测 中。