申请日2006.09.07
公开(公告)日2008.08.13
IPC分类号A01P7/04; A01N63/02
摘要
本发明公开了一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。本发明的制备方法包括污泥调理、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、发酵液后处理与产品质量检验。本发明为污泥提供一条新型高附加值的资源化处置途径，具有处置污泥与生产微生物灭蚊剂的双重功效。同时本发明可以降低微生物灭蚊剂的生产成本，有利于促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
权利要求书
1. 一种利用城市污泥制备微生物灭蚊剂的方法，其特性在于包括如下步骤：
(1)污泥调理：将城市污泥的含固率调至2-5%，加入1-5g/L消泡剂，用 酸或碱调pH为6.5-8.0，搅拌均匀后，灭菌，冷却至30-35℃备用;
(2)摇瓶培养：将Bti或Bs接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的瓶中， 进行摇瓶培养，培养条件为：温度28-32℃、转速150-250转/分，瓶装液量20-40%， 培养时间8-12小时;
(3)种子罐发酵：将Bti或Bs摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3%，进 行发酵培养，培养条件为：罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气体 积量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时;
(4)发酵罐发酵：按2-8%的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐，培 养条件为：罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气体积量为培养基体 积的1.0-1.5倍、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株 的发酵时间为30-36小时，Bti菌株的发酵时间为36-42小时;
(5)发酵液后处理：发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然 后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂， 搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消泡剂为 泡敌、聚丙二醇、豆油或花生油。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的酸是指 磷酸、硫酸或盐酸。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱是指 KOH、NaOH或Ca(OH)2。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述灭菌是指 在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的无机酸 是指硫酸、盐酸或硝酸。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的防腐剂 是山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金甲酯。
说明书
一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种灭蚊剂，具体地说，涉及一种利用城市污泥制备的微生物 灭蚊剂及其制备方法。
背景技术
城市污泥是污水 处理过程中必然产生的沉淀物。目前，我国城市污泥年产 生量约700万吨干重，根据我国城市污水处理目标，预计到2010年污泥产生量 将超过800万吨干重。如何妥善处置这些数量日益庞大、高度集中的有机固体废 弃物，是城市污水处理厂最头痛的问题之一。
在国际上，现行污泥的处置方式主要有：填埋、土地利用、焚烧等，但它 们都存在各自难以克服的缺陷，并且也不能满足当前的实际需要。例如，污泥填 埋占地面积大，合适的填埋场地正急剧减少，并且污泥中有害成分的渗漏会对地 下水造成污染：污泥土地利用存在因污泥大量施用造成的重金属、有机污染物与 病原体等物质污染食物链与威胁人类健康的问题;面污泥焚烧的投资成本和操作 费用高，处理成本是填埋法、土地利用的好几倍，并且技术要求高，容易产生二 噁英等二次污染物。
在我国，目前城市污泥的主要处置方式是随意弃置与简单填埋，这不仅极 大地浪费了污泥中大量的有机质和氮、磷等植物养分，而且已成为水土环境的新 隐患，严重干扰了污水处理厂的正常运行。缺乏稳定、环境安全与经济有效的资 源化技术是当前我国城市污泥所面临的实际现状。
蚊虫是人类最主要的卫生害虫之一，不仅吸血扰人，而且是多种严重疾病 的传播媒介。在世界范围内，每年因蚊虫的传播致使24亿人(约占全球总人口 的40%)遭受疟疾、丝虫病、登革热、黄热病、乙型脑炎的威胁，每年由于感染 上述五种蚊媒疾病而发病死亡的人数超过200万。我国是蚊媒疾病流行国家之 一，灭蚊控病任务十分紧迫，特别是近年来登革热等蚊媒疾病在沿海等城市发病 明显上升。控制蚊虫被认为是消除蚊虫蚊媒疾病的有效途径。20世纪50年代在 世界卫生组织(WHO)的倡导下，人们开始采用六六六、DDT等化学灭蚊剂来 控制成蚊密度。但是，随着化学灭蚊剂长期大量使用所导致的蚊虫抗药性，以及 环境污染和生态平衡破坏等问题的日益严重，迫切需要新的安全有效的蚊虫综合 防治方法。微生物灭蚊策略越来越受重视。
目前，已相继发现球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus，简称Bs)、苏云金芽 孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)、厌氧双酶 梭菌马来西亚亚种(Clostridium bifermentans subsp.malaysia)与大链壶菌 (Lagenidium giganteum)等对蚊幼虫有特异性毒杀作用，它们对非靶生物包括 人畜安全(可用于饮用积水)，同时也不破坏生态平衡和污染环境。在这些杀蚊 微生物中，Bs与Bti两种芽孢杆菌的杀蚊幼效果最好，应用最为广泛。它们杀蚊 的主要活性成分是代谢过程中产生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼虫吞食后在肠道碱 性环境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻击蚊幼虫中肠刷状缘上皮细胞膜，杀伤这 些细胞，最终导致幼虫死亡。
Bti与Bs微生物灭蚊剂的主要生产工艺是液体深层发酵，以黄豆饼粉、棉 籽饼粉、玉米粉蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等为主要原料，原料成本约占总生产 成本的20-35%。目前，制约它们大规模应用的主要因素有两个：一是生产原料 昂贵，造成产品使用价格较高，抵消了其作为生物灭蚊剂的优越性;二是发酵水 平低。这两种芽孢杆菌，尤其是Bs在发酵中往往不能同步成熟，发育同步性能 差(普遍报道抗热芽孢的形成率只有48-72%)，导致产品的杀蚊活性不高。
近20年来，有研究者尝试采用廉价的农副产品或有机物含量丰富的有机废 弃物作为原料发酵生产微生物灭蚊剂。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精 工业产生的有机废液(经水解预处理)作为主要培养基发酵生产Bti灭蚊剂，发 酵罐试验表明，经过24-48h的通气搅拌培养，发酵液中Bti菌数达2.5×109个 细菌/mL，对埃及伊蚊幼虫(Aedes aegypti)的LC50为0.063mg/L，显著高于常 规的合成培养基。Obeta等(1983)利用猪血、豆科植物种籽和矿质盐制备的几 种培养基，发现在这些培养基中Bs 1593菌株都能良好的生长与产孢产毒，从而 制备Bs灭蚊剂。然而，这些原料具有季节性和分散性，往往不能及时供给，并 且通常需要繁琐、昂贵的预处理(如水解、浸提与浓缩处理等)，因而并未得到 大规模的实际应用。
城市污泥的产生具有日常性与集中性，并且含有大量可被微生物利用的碳、 氮、磷以及微量元素等营养物质。WO 95/35365(1995)与CN 1772879A(2006) 公开了以污泥作为发酵原料、以苏云金杆菌作为发酵菌种生产苏云金杆菌生物杀 虫剂。但它们所生产的生物杀虫剂的防治对象是农作物害虫，没有涉及到卫生害 虫蚊类。经文献与专利检索，在现有技术中还未发现利用城市污泥制备生物灭蚊 剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的不足，提供一种杀蚊效果好，对环境 安全无害的微生物灭蚊剂。
本发明的另一个目的是提供上述微生物灭蚊剂的制备方法，在灭蚊剂制备 过程中实现污泥的资源化处置。
为了实现上述目的，本发明采用液体深层发酵方法，包括如下步骤：
1)培养基调理：调节城市污泥的含固率为2-5%，加入1-5g/L消泡剂，用 酸或碱调pH为6.5-8.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃ 下灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、 豆油、花生油等，最好是泡敌。所用的酸是指磷酸、硫酸或盐酸，其中最好是磷 酸;所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是KOH。
2)摇瓶培养：从保藏正常的Bti或Bs斜面培养基上挑取一环接种到装有牛 肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为：温度28-32℃、转 速150-250转/分，三角瓶装液量20-40%，培养时间8-12小时。牛肉膏蛋白胨液 体培养基的成分为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL;pH 7.2-7.5， 15磅压力与121℃下灭菌30分钟。所用Bti与Bs菌株是WHO推荐或厂家普遍 使用的高毒力菌株，具体来说，Bti是指苏云金芽孢杆菌H14血清型，主要是187 与1897菌株;Bs包括2362、1593、2297等3种，上述菌株可在国内微生物保 藏机构通过直接购得。
3)种子罐发酵：将Bti或Bs摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3%，进行 发酵培养。条件为：罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/ 分)、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时。
4)发酵罐发酵：按2-8%的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐。培养 条件为：罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速 度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的适宜发酵时间为30-36 小时，Bti菌株的适宜发酵时间为36-42小时。
5)发酵液后处理：发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后 用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅 拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品;所述的无机酸是指硫酸、盐酸或硝 酸，其中最好是盐酸;所述的防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金 甲酯，其中最好是山梨酸钾。
6)产品质量检验：产品中抗热性芽孢的测定方法：采用无菌操作，将液体 产品进行梯度稀释，取适宜稀释度的菌液于80℃水浴处理15min，然后进行涂布 培养计数，每平板菌落数30-300个有效。产品生物毒力效价测定方法：按照WHO 标准程序进行，试虫为淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedes albopictus)二龄末至三龄初的健康幼虫。合格产品中抗热芽孢数≥109个/毫升， 生物测定毒力效价≥100ITU/mg。
g/L是指每1L培养基液体中加入目标物的克数;
%是指每百份质量的培养基液体中接入接种物的质量份数;
V/V/分是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积份数。
本发明的技术原理是：以城市污泥所含的碳水化合物与蛋白质、磷以及微量 元素为主要营养物质，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，Bti或Bs菌株 得以生长与增殖，形成抗热性芽孢与毒素蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩制 成微生物灭蚊剂产品。所制备的灭蚊制剂为液体剂型，可有效杀灭库蚊与伊蚊的 幼虫，并且对环境安全无害。所述液体剂型中抗热性芽孢含量不低于109个/毫升， 对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedes albopictus)2-3龄幼虫的 生物毒效不低于100ITU/mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)为城市污泥提供了一条崭新资源化处置途径，同时降低了微生物灭 蚊剂的生产成本。
(2)与现有污泥处置技术相比，本方法不仅处置了污泥，而且可获得附 加值较高的灭蚊剂产品，从而降低了污泥处理处置成本。
(3)现有微生物灭蚊剂的生产原料主要是黄豆饼粉、花生饼粉、玉米粉、 蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本 发明中Bti或Bs菌株主要依靠城市污泥中自身的可利用成分(糖分、蛋白质与 矿质盐等)生长与增殖，添加的成分较少，大大降低了微生物灭蚊剂的生产成本， 从而促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
(4)现有微生物灭蚊剂发酵生产中一个技术瓶颈是抗热芽孢形成率低 (48-72%)。也就是说细菌发育同步性能差，从而导致产品的杀蚊活性不高。以 城市污泥替代黄豆饼粉等常规原料，可以提高Bti与Bs的发育同步性，倒罐时 (30-42小时)抗热芽孢形成率可达到85%以上。