申请日2011.04.11
公开(公告)日2011.10.19
IPC分类号C12N15/10
摘要
一种污水处理反应器中污泥DNA的提取方法，具体是一种厌氧反应器污泥DNA的提取方法。DNA的提取是分子生物学技术研究的基础，DNA提取的质量对后续的研究影响非常大，高质量的DNA可以为分子生物学研究提供准确的信息，现有厌氧污泥的DNA提取方法普遍存在提取难度大、杂质多、产量低的缺点，在一定程度上限制了人们对厌氧污泥的研究。本发明针对现有厌氧反应器污泥DNA的提取方法存在提取难度大、杂质多、产量低的缺点，提供一种厌氧反应器污泥DNA的有效提取方法。本发明提取的DNA具有产量大、易提取、纯度高的特点。
权利要求书
1.一种污水处理厌氧反应器活性污泥DNA的提取方法，其特征在于提取厌氧反应器活性污泥DNA的方法按如下步骤进行：
(1)取大约30ml污水样品，在4℃下，以9000转/分钟的转速离心5分钟，去掉液体，收集沉淀;
(2)加入5倍沉淀体积的TENP缓冲液和3粒灭菌玻璃珠充分震荡5分钟，在4℃下，以9000转/分钟的转速离心5分钟，去掉液体，收集沉淀，重复此步骤直到上清夜较为澄清;
(3)加入5倍沉淀体积的PBS缓冲液，充分震荡，在4℃下，以9000转/分钟的转速离心5分钟，去掉液体，收集沉淀，此步骤重复2次;
(4)加入5倍沉淀体积的PBS缓冲液悬浮;
(5)收集1g预处理好的污泥样品，加200μl提取缓冲液，加2粒玻璃珠，充分震荡5分钟，使样品充分悬浮;
(6)将悬浮液放在-25℃冰箱中冷冻30分钟后放入65～70℃水浴中加热30分钟，每隔10分钟摇晃一次，使细胞充分裂解，此步骤重复3次;
(7)加入4μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，室温放置5分钟，然后置于94℃水浴中放置1分钟;
(8)加入400μL SDS缓冲液，1μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，1.5μL浓度为20mg/mL的RNA水解酶，混合后置于37℃水浴中放置1小时;
(9)加入与混合液等体积Tris-饱和酚，混匀，在室温下，12000转/分钟离心5分钟，将上清液转入另一离心管中;
(10)加入与上清液等体积混合液，混合液组成为苯酚/氯仿/异戊醇，苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25∶24∶1，混匀，在室温下，12000转/分钟离心5分钟，吸取上清液至另一的离心管中;
(11)加入0.6倍上清液体积的异丙醇混匀，室温放置2小时，在室温下，12000转/分钟离心10分钟，弃上清液;
(12)沉淀用70%的乙醇洗涤3次，室温干燥后加入灭菌蒸馏水溶解沉淀，所得即为DNA。
2.按权利要求1所述的一种厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法，其特征在于：步骤(2)中加入5倍沉淀体积的TENP缓冲液和3粒灭菌玻璃珠充分震荡5分钟，重复此步骤直到上清夜较为澄清。
3.按权利要求1所述的一种厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法，其特征在于：步骤(2)中所用的TENP缓冲液中个组分的浓度分别为：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/ml PVP，TENP缓冲液的pH值为10。
4.按权利要求1所述的一种厌氧反应器活性污泥DNA的提取方法，其特征在于：步骤(6)中将悬浮液放在-25℃冰箱中冷冻30分钟后放入65～70℃水浴中加热30分钟，每隔10分钟摇晃一次，重复此步骤3次。
说明书
一种厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法
技术领域
本发明涉及污水处理生化反应器中活性污泥DNA的提取方法，具体是一种厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法。
背景技术
厌氧生物处理反应器是目前污水处理领域研究的热门，研究厌氧生物处理反应器的微生物对于揭示厌氧处理的反应机理具有重要意思，传统的微生物分离纯培养技术很难全面客观的研究其中的厌氧微生物，目前实验室中可培养的微生物还不到自然界中微生物总数的1%，厌氧微生物更少，而且还有很多因无法培养而未被人们所认识的微生物。分子生物学技术的引入对于这个难题有了根本的解决办法，使人们摆脱了对培养技术的依赖，从分子角度研究微生物的特性，大大促进了厌氧技术的发展。
从环境样品中提取高质量的总DNA，是做好PCR、DGGE等的前提条件，DNA提取的质量对于菌群多样性的分析起着至关重要的作用。从环境样品中提取的DNA要求必须能够代表该样品中遗传多样性的实际情况，PCR、DGGE等对DNA都有很高的要求，因此有针对性的选择合适的DNA提取方法并提取出高质量的DNA是十分重要的。
由于厌氧反应器污泥中的厌氧微生物较为复杂，并且难以破壁，普通的DNA提取方法往往得率较少，而且由于厌氧反应器污泥中所含腐植酸、蛋白质和糖类物质较多，因此通常难以提取到纯度较高的DNA，而这些物质会对后续的PCR反应产生抑制性和干扰性的影响，进而影响后面的DGGE、连接和转化等。
发明内容
本发明针对现有厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法存在提取难度大、杂质多、产量低的缺点，提供一种厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法。本发明提取厌氧反应器污泥DNA的方法按如下步骤进行：
(1)取大约30ml污水样品，在4℃下，以9000转/分钟的转速离心5分钟，去掉液体，收集沉淀;
(2)加入5倍沉淀体积的TENP缓冲液和3粒灭菌玻璃珠充分震荡5分钟，在4℃下，以9000转/分钟的转速离心5分钟，去掉液体，收集沉淀(重复此步骤直到上清夜较为澄清);
(3)加入5倍沉淀体积的PBS缓冲液，充分震荡，在4℃下，以9000转/分钟的转速离心5分钟，去掉液体，收集沉淀(此步骤重复2次);
(4)加入5倍沉淀体积的PBS缓冲液悬浮;
(5)收集1g预处理好的污泥样品，加200μL提取缓冲液，加2粒玻璃珠，充分震荡5分钟，使样品充分悬浮;
(6)将悬浮液放在-25℃冰箱中冷冻30分钟后放入65～70℃水浴中加热30分钟，每隔10分钟摇晃一次，使细胞充分裂解(此步骤重复3次);
(7)加入4μL溶菌酶(50mg/mL)，室温放置5分钟，然后置于94℃水浴中放置1分钟;
(8)加入400μL SDS缓冲液，1μL蛋白酶K(20mg/mL)，1.5μL RNA水解酶(20mg/ml)，混合后置于37℃水浴中放置1小时;
(9)加入与混合液等体积Tris-饱和酚，混匀，在室温下，12000转/分钟离心5分钟，将上清液转入另一离心管中;
(10)加入与上清液等体积混合液，混合液组成为苯酚/氯仿/异戊醇，苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25∶24∶1，混匀，在室温下，12000转/分钟离心5分钟，吸取上清液至另一的离心管中;
(11)加入0.6倍上清液体积的异丙醇混匀，室温放置2小时，在室温下，12000转/分钟离心10分钟，弃上清液;
(12)沉淀用70%的乙醇洗涤3次，室温干燥后加入灭菌蒸馏水溶解沉淀，所得即为DNA。
本发明厌氧反应器污泥DNA的提取方法步骤(2)中所用到的TENP缓冲液中的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的主要功能是去除腐殖质，因为厌氧反应器中的腐殖质含量大，腐殖质中所含的腐植酸对后面的PCR反应会起到抑制作用，TENP缓冲液可以有效的去除腐殖质，提高DNA的纯度。
本发明厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法步骤(6)中将悬浮液放在-25℃冰箱中冷冻30分钟后放入65～70℃水浴中加热30分钟，每隔10分钟摇晃一次，重复此步骤3次，反复冻融的原理是在-25℃时由于细胞内形成冰粒而使剩余细胞液的盐浓度增大而引起细胞破碎。
本发明的积极效果是，通过加入TENP缓冲液与玻璃珠对厌氧污泥样品的预处理和反复冻融法的使用，使厌氧污泥的DNA提取效率大大提高，运用本方法提取的DNA产量大、易提取、纯度高。另外，本方法可操作性强，TENP缓冲液配制方法简单，玻璃珠价格便宜，冰箱和水浴锅都是实验室常用仪器，不需要特殊仪器，实验成本较低。