申请日2012.03.14
公开(公告)日2012.07.25
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C02F101/38; C12R1/40; C02F3/02
摘要
本发明公开了一种恶臭假单胞菌，保藏名称为：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CT2025，保藏日期：2012年02月17日，保藏号：CGMCC NO.5767。本发明还同时公开了一种含咖啡碱废水的无害化处理方法：在每100吨的含咖啡碱废水中接种入0.8～1.2kg的恶臭假单胞菌，在以下任意一个废水处理的阶段介入应用：在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，在废水需氧处理结束后应用。
权利要求书
1.一种恶臭假单胞菌，其特征是：保藏名称为：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) CT2025，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所;保藏日期：2012年02月17日，保藏 号：CGMCC NO.5767。
2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌的扩繁法，其特征是：将恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)CGMCC NO.5767接种于扩繁液体培养基中，于28～30℃、130～150转 /分钟条件下扩繁培养，当所得扩繁产物的在600纳米处的吸光度≥4时，停止扩繁培养。
3.根据权利要求2所述的恶臭假单胞菌的扩繁法，其特征是：
所述扩繁液体培养基为：每升扩繁液体培养基中含有5.0毫摩尔的氯化钾、1.5毫摩尔 的硫酸亚铁、1.5毫摩尔的硫酸镁、0.4毫摩尔的氯化钙、0.3毫摩尔的磷酸氢二钠、0.15微 摩尔的硼酸、0.05微摩尔的硫酸铜、0.05微摩尔的硫酸锰、0.05微摩尔的钼酸钠、0.05微摩 尔的硫酸锌、蔗糖10克、蛋白胨10克、咖啡碱2.5～7.5毫摩尔，其余为水;调节pH7.0后， 高温灭菌。
4.一种含咖啡碱废水的无害化处理方法，其特征是：在每100吨的含咖啡碱废水中 接种入0.8～1.2kg的恶臭假单胞菌，在以下任意一个废水处理的阶段介入应用：
在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，
在废水需氧处理结束后应用;
所述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CGMCC NO.5767。
说明书
含咖啡碱废水的无害化处理方法及所用菌
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明涉及一种利用细菌降解咖啡碱进行含 咖啡因废水的无害化处理方法。
背景技术
茶多酚是从茶叶中提取的重要生理活性成分，具有抗氧化、抗辐射、抗突变、抗肿 瘤、抗衰老等诸多功能，在功能食品和医药领域具有良好的应用前景，因此，茶多酚提取 和纯化产业发展非常迅猛，到2011年，全国茶多酚生产企业超过60家，规模在100吨以上 的企业有10余家，年产量4000吨以上。茶多酚常采用萃取、净化、提纯和干燥等工艺制备 而成，其中提纯工序是影响产品质量最重要的工序。茶多酚的提纯工序主要目的是去除咖 啡碱等杂质。从茶多酚中脱除咖啡因等杂质的主要方法有：有机溶剂(如氯仿等)萃取、 金属离子沉淀(如Ca2+等)/酸转溶/乙酸乙酯萃取、逆流色谱和树脂吸附分离等几种方法， 这些方法各有各的优缺点，但是所有的方法都会产生一定数量的含茶多酚、咖啡碱、果胶、 蛋白、氨基酸以及一些胶状颗粒物的废水，其中茶多酚、果胶、蛋白、氨基酸和颗粒物对 废水的化学耗氧量(COD)、生物耗氧量(BOD)、悬浮物(SS)和色度等有重要影响， 是茶多酚生产和精制企业废水无害化处理过程中的主要目标物。目前，较大规模的茶多酚 生产和精制企业对废水处理已经相当重视，采取的方法一般为：将生产过程中的废水收集 入集水池，加入混凝剂或絮凝剂以去除茶多酚和胶状悬浮颗粒，之后依次进行微生物无氧 发酵和需氧发酵以去除废水中的大部分有机物，最后通过生物滤池去除微生物并释放。
咖啡碱，又名咖啡因，白色针状晶体，具有较强的中枢神经兴奋作用和利尿作用， 被广泛用于医药、食品、化妆品等领域。在茶叶及其片末副产品中，咖啡碱含量一般为1-5%。 在提取茶多酚或者茶多酚精制过程产生的废水中，均含有相当数量的咖啡碱，由于采用的 工艺不同，废水中咖啡因含量在每升几百毫克到上千毫克不等。咖啡碱在我国属于管制产 品，其生产必须获得有关部门的严格审批。普通的茶多酚提取或者精制企业一般很难获得 生产授权。因此，茶多酚生产企业对生产过程废水中所含的咖啡因一般不会采取回收措施。 研究显示，即使是较低浓度的咖啡碱对水生动植物即具有明显的毒性，因此咖啡碱对水生 环境具有很大的潜在破坏作用。由于咖啡碱对酸碱和普通氧化剂处理均表现出很强的抗 性，普通的微生物一般也很难降解利用咖啡因，而且溶解在水中的咖啡因分散性好、不会 像其它污染物一样对水体色度等产生视觉影响，因此，即使废水中含有较高浓度的咖啡因 一般也很难在生物耗氧量、悬浮物和色度等的监测指标中得到反映，从而导致废水中残存 的咖啡碱很容易被忽视。而且，目前也没有有效的含咖啡因废水的处理技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、条件温和、效果稳定的含咖啡碱废水 的无害化处理方法及所用的恶臭假单胞菌，按照本发明的方法能利用生物发酵途径高效去 除废水中的咖啡碱。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种恶臭假单胞菌，保藏名称为：恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)CT2025，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所;保藏日期： 2012年02月17日，保藏号：CGMCC NO.5767。
本发明还同时提供了上述恶臭假单胞菌的扩繁法：将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CGMCC NO.5767接种于扩繁液体培养基中，于28～30℃、130～150转/分钟条件下扩 繁培养，当所得扩繁产物的在600纳米处的吸光度≥4时，停止扩繁培养。
作为本发明的恶臭假单胞菌的扩繁法的改进：
扩繁液体培养基为：每升扩繁液体培养基中含有5.0毫摩尔的氯化钾、1.5毫摩尔的硫 酸亚铁、1.5毫摩尔的硫酸镁、0.4毫摩尔的氯化钙、0.3毫摩尔的磷酸氢二钠、0.15微摩尔 的硼酸、0.05微摩尔的硫酸铜、0.05微摩尔的硫酸锰、0.05微摩尔的钼酸钠、0.05微摩尔的 硫酸锌、蔗糖10克、蛋白胨10克、咖啡碱2.5～7.5毫摩尔，其余为水;调节pH7.0后，高温 灭菌。
本发明还同时提供了一种含咖啡碱废水的无害化处理方法：在每100吨的含咖啡碱废 水中接种入0.8～1.2kg的恶臭假单胞菌(鲜重)，在以下任意一个废水处理的阶段介入应用：
在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，
在废水需氧处理结束后应用;
上述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CGMCC NO.5767。
本发明所得的在600纳米处的吸光度≥4的扩繁产物(即包含扩繁液体培养基的恶臭 假单胞菌(Pseudomonas putida))既可用于菌种保存，也用于含咖啡碱废水的处理。菌种 保存的方法是，在菌液(即在600纳米处的吸光度≥4的扩繁产物)中加入相当于菌液体积 20%的二甲基亚砜，置于零下20度～零下70度冰箱保存。
在本发明含咖啡碱废水的无害化处理方法中，恶臭假单胞菌(鲜重)是指：将上述 菌液(即在600纳米处的吸光度≥4的扩繁产物)在2000-5000转/分钟的条件下离心10-15分 钟所收集的细菌沉淀。
本发明适用于活性污泥法处理含咖啡碱废水，可在废水处理的三个阶段介入应用： 既可在混凝或絮凝后废水中应用，也可在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，还可在常规 废水需氧处理结束后应用(见图1)。作为介入阶段优化：该菌在厌氧发酵后的需氧处理阶 段介入，不仅咖啡碱降解彻底，而且可与原有废水处理工艺无缝衔接，基本无新增成本。 介入应用的方法为：首次使用时(即首次投入菌时)，可根据需氧发酵曝气池的大小，按 照1千克细菌(鲜重)100吨废水的比例接种于常规的需氧曝气池中，常规曝气适应3-5天 (即当恶臭假单胞菌接入后，对废水进行常规的曝气增氧发酵3-5天，常温(一般为15-30 ℃)即可)，以利该菌定植于污泥中。之后再次处理废水时，可按照常规的污水需氧处理 方法进行含咖啡碱废水的无害化处理，即，废水在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48～160 小时，处理温度控制在15-30℃。当废水中的咖啡碱浓度低于500毫克/升时，在需氧曝气池 (罐)中的处理时间为48小时;当废水中的咖啡碱浓度为500-1500毫克/升时，在需氧曝气 池(罐)中的处理时间为96小时;当废水中的咖啡碱浓度超过1500毫克/升时，在需氧曝 气池(罐)中的处理时间为96～160小时。因此，当废水中咖啡碱浓度低于500毫克/升时， 每天可将相当于接入菌种量5万倍的废水中咖啡碱彻底降解;当废水中咖啡碱浓度在 500-1500毫克/升时，每天可将相当于接入菌种量的2.5万倍的废水中咖啡碱彻底降解;当 废水中咖啡碱浓度超过1500毫克/升时，可将相当于介入菌种量的1.5-2.5万倍废水中的咖啡 碱彻底降解。废水处理时最适温度应控制在15-30℃。
本发明的主要特点是：1)利用从茶园土壤分离的恶臭假单胞菌可高效分解咖啡碱的 特点，进行了普通化学氧化和微生物发酵很难去除的咖啡碱的生物降解和无害化处理;2) 与常规的茶多酚生产精制废水处理工艺衔接良好，几乎无额外投入;3)可在原有废水处 理工艺中的需氧发酵阶段介入，咖啡碱去除彻底。4)、本发明的方法适用于去除茶多酚提 取或茶多酚精制过程中产生的含咖啡因废水中的咖啡因。