申请日2012.04.24
公开(公告)日2013.01.02
IPC分类号C12N1/21; C02F101/34; C12R1/125; C02F3/34
摘要
一株降解石化废水中苯酚的基因工程菌，它涉及一株降解苯酚的基因工程菌。本发明解决了现有从石化废水中分离鉴定的野生菌株苯酚降解能力较低的问题。本发明一株降解石化废水中苯酚的基因工程菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号为CGMCC No.5619。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，96小时内最高可将10mg/L苯酚降解到0.3825mg/L，最高降解率可达96.18%，达到国家一级排放标准。
权利要求书
1.一株降解石化废水中苯酚的基因工程菌，其特征在于它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号为CGMCC No.5619。
说明书
一株降解石化废水中苯酚的基因工程菌
技术领域
本发明涉及一株降解苯酚的基因工程菌。
背景技术
酚类化合物毒性强，是我国优先控制的污染物之一，同时也是美国环保局列出的129 种优先控制物之一。含酚废水主要来源于焦化、煤气、炼油和以苯酚或酚醛为原料的化 工、制药等生产过程，其来源广、数量多、污染水源，毒死鱼虾，危害庄稼，严重危害 人类健康。在过去十年中，降解苯酚的微生物，已愈来愈受到关注。
目前的相关研究中已经从石化废水中分离鉴定了一些苯酚降解菌，包括苏云芽孢杆 菌和假单胞菌等，但是，其中的降解微生物大多是从污泥中驯化得到的野生菌，其苯酚 降解能力较低，处理效果不太理想，且菌群内的微生物种类繁多、关系复杂，也给研究 带来了不便。
发明内容
本发明目的是为了解决现有从石化废水中分离鉴定的野生菌株苯酚降解能力较低的 问题，而提供一株降解石化废水中苯酚的基因工程菌。
本发明降解石化废水中苯酚的基因工程菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) dqly-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号为CGMCC No.5619; 它为革兰氏阳性好氧菌，长为1.0～1.2μm，宽为0.7～0.8μm，内生孢子，孢子中生，游离 孢子的表面着色弱，鞭毛侧生;洋菜培养基上形成不规则的圆形菌落，表面色暗，不透明， 粗糙，可起皱，奶白色或褐色。
本发明降解石化废水中苯酚的基因工程菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) dqly-2，它的pH生长范围为5.5～8.5，最适pH值为7.2;最适生长温度为28～37℃，最高 生长温度为55℃，最低生长温度为5～20℃。
本发明降解石化废水中苯酚的基因工程菌，它为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) dqly-2，其接触酶呈阳性、葡萄糖产气呈阴性、阿拉伯糖产酸呈阳性、甘露醇产酸呈阳性、 0.02%叠氮钠生长呈阴性、柠檬酸钠洋菜上产碱呈阳性、酪氨酸水解呈阴性、淀粉水解 +NO3→NO2呈阳性、厌氧洋菜中生长呈阴性、葡萄糖产酸呈阳性、V.P呈阳性、木糖产酸 呈阳性、卵黄反应呈阴性、7%NaCl中生长呈阳性、水解酪素呈阳性、还原石蕊牛奶呈阳 性、马尿酸盐水解呈阴性。
本发明中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，是将邻苯二酚2，3双加氧酶基因和 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PHT304分别进行EcoR I和HindIII双酶切后连接， 并转入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BHf3-4中，构建获得的基因工程菌，命名为枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2。
本发明中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011 年12月20日，保藏编号为CGMCC No.5619。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，96小时内最高可将10mg/L苯酚降解 到0.3825mg/L，最高降解率可达96.18%，达到国家一级排放标准(0.5mg/L)。本实施方 式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BHf3-4 相比，酚降解率有极显著提高。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任 意组合。
具体实施方式一：本实施方式降解石化废水中苯酚的基因工程菌，它为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)dqly-2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年12月20日，保藏编号 为CGMCC No.5619。
本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2为革兰氏阳性好氧菌，长为 1.0～1.2μm，宽为0.7～0.8μm，内生孢子，孢子中生，游离孢子的表面着色弱，鞭毛侧生; 洋菜培养基上形成不规则的圆形菌落，表面色暗，不透明，粗糙，可起皱，奶白色或褐色。
上述洋菜培养基(1L)由10g的胰化蛋白胨、5g的酵母提取物、10g的NaCl、12g 的琼脂和余量的蒸馏水组成，调pH值为7.0。
本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2进行生理生化鉴定：其接触酶 呈阳性、葡萄糖产气呈阴性、阿拉伯糖产酸呈阳性、甘露醇产酸呈阳性、0.02%叠氮钠生 长呈阴性、柠檬酸钠洋菜上产碱呈阳性、酪氨酸水解呈阴性、淀粉水解+NO3→NO2呈阳 性、厌氧洋菜中生长呈阴性、葡萄糖产酸呈阳性、V.P呈阳性、木糖产酸呈阳性、卵黄反 应呈阴性、7%NaCl中生长呈阳性、水解酪素呈阳性、还原石蕊牛奶呈阳性、马尿酸盐水 解呈阴性。
本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，它的pH生长范围为5.5～8.5， 最适pH值为7.2;最适生长温度为28～37℃，最高生长温度为55℃，最低生长温度为5～20 ℃。
本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，是将邻苯二酚2，3双加氧酶基 因(全长为823bp，其序列如SEQ ID NO：1所示)和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载 体PHT304(表达载体PHT304购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)分别进行 EcoR I和HindIII双酶切后连接，并转入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BHf3-4中， 构建获得的基因工程菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BHf3-4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4046，它在发明专利“可降解焦化废水中酚和氰的 微生物及用其处理焦化废水的方法(申请号为：201010504115.6，申请日为：2010.10.12)” 中已公开。
构建成功后，在苯酚终浓度为10mg/L的150mL枯草芽孢杆菌培养基中分别接种枯 草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BHf3-4和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2，在完全 相同的条件下培养，分别在接种后6、24、48、72、96h取15mL菌液，离心取上清10mL， 以4-氨基安替比林直接分光光度法检测剩余苯酚量，对两种菌的苯酚降解能力进行比较。
结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BHf3-4，96小时内最高可将10mg/L苯 酚降解到1.5217mg/L，最高降解率可达84.78%。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2， 96小时内最高可将10mg/L苯酚降解到0.3825mg/L，最高降解率可达96.18%，达到国家 一级排放标准(0.5mg/L)。本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dqly-2与枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)BHf3-4相比，酚降解率有极显著提高。