申请日2013.11.08
公开(公告)日2014.03.19
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12R1/07; C02F103/28; C12R1/38; C12R1/01; C12R1/40
摘要
本发明公开了一种用于降解制浆造纸废水的复合菌群及其制备方法，该制备方法分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)接种培养;按体积百分比计，分别取5～8%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，2～5%杆状菌(Bacillus sp.)，10～15%阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，26～41%恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和34～56%施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)活化后，混合投入到废水中。本发明通过菌种间的协调作用，能有效提高微生物降解制浆造纸废水的效率。
权利要求书
1.一种用于降解造纸废水的复合菌群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)五种细菌对数生长期细胞的制备：分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状 菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆菌(Enterobacter.cloacae.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)， 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)五种菌1～2环，将其分别转移到含20～50mL营养液中， 每种细菌在27～35℃的条件下培养1～2天，再将培养后的五种菌按菌体与增殖培养基体积比 分别以1:9～1:12的体积比例接种至含300～500mL增殖培养基的容器中，采用不同的增殖培养 基培育;其中，土壤杆菌、杆状菌和阴沟肠杆菌的营养培养基为牛肉膏1.5g～2.0/L，葡萄糖 1.0～2.0g/L，胰蛋白胨6.0～7.0g/L，酵母粉3.0～4.0g/L，其余为水;施氏假单胞菌和恶臭假单 胞菌营养培养基为新鲜马铃薯汁800～1000mL，葡萄糖16～20g，其余为水(马铃薯汁的制备 方法：取去皮新鲜马铃薯160～200克，切成小块，加去离子水800～1000mL煮沸30分钟，滤 去马铃薯块，用去离子水将滤液补足至800～1000mL);然后在27～35℃的条件下培养1～2天， 以6000～7000rpm的速度离心10～15min后，分别获得上述五种菌体的对数生长期细胞;所 述营养液主要成分为牛肉膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L，酵母粉 3.0～4.0g/L，pH6.5～7.5，其余为水;
(2)五种菌体的混合菌群的复配：将所述五种菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐 缓冲液洗涤2～3次后，按体积百分比计，分别取5～8%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，2～5% 杆状菌(Bacillus sp.)，10～15%阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，26～41%恶臭假单胞 菌(Pseudomonas putida)和34～56%施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)混合;得用于 降解造纸废水的复合菌群。
2.根据权利要求1所述的用于降解造纸废水的复合菌群的制备方法，其特征在于，所 述复合菌群降解造纸废水时，取复合菌群的混合菌液以1:15～1:30的体积比例投加到营养液 中进行培养6～12h，使复合菌群活化后直接投入到造纸废水中，每1升造纸废水加入混合 菌液1～2mL;曝气处理2～4d，曝气量为2～4L/h。
3.根据权利要求2所述的用于降解造纸废水的复合菌群的制备方法，其特征在于，所 述营养液主要成分为牛肉膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L，酵母粉 3.0～4.0g/L，pH6.5～7.5，其余为水。
4.根据权利要求1所述的用于降解造纸废水的复合菌群的制备方法，其特征在于，按 体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠8.0～9.0g/L，氯化钾0.2～0.3g/L，磷酸氢 二钾1.1～1.2g/L和磷酸二氢钾0.2～0.3g/L，其余为水。
5.根据权利要求1或3所述的用于降解造纸废水的复合菌群的制备方法，其特征在于， 所述磷酸盐缓冲液的洗涤次数为2～3次。
6.一种用于降解造纸废水的复合菌群，其特征在于，由权利要求1、4或5所述制备 方法制得。
说明书
一种用于降解造纸废水的复合菌群及其制备方法
技术领域
本发明涉及造纸废水处理领域，具体涉及一种用于降解造纸废水的复合菌群及其制备方 法。
背景技术
生物处理是当前常用的废水处理方法，这种方法通过微生物的新陈代谢作用，将废水中 的污染物质分解、吸收，从而达到治理污染的目的。生物处理法与其他方法相比，其成本低， 效率高，而且容易操作，最重要的是没有二次污染，因此，在废水处理中得到了广泛的应用。 随着经济的发展，废水的成分日益复杂，尤其当废水中含有有毒、难降解的有机污染物时， 由于对该类有机物具有专项降解能力的微生物在环境中的种类、数量较少，同时它在种间竞 争中处于劣势，因此，传统的生物处理技术面临极大挑战。如果在传统的生物处理体系中投 加具有特定功能的微生物或某些基质，增强它对特定污染物的降解能力，从而改善整个污水 处理体系的处理效果，我们称这种技术为生物强化技术。
生物强化技术中投加的微生物可以来源于原有处理体系，经过驯化、富集、筛选、培养， 从而达到一定数量的微生物，也可以是原来不存在的外源微生物或遗传工程菌。其中优势菌 种在系统中的稳定性是决定生物强化运行的关键所在。我们前期研究表明经过统计学方法可 以研究微生物种群间的相互作用，筛选组成微生物优势种群，其生物强化作用优于单一菌种 的生物强化效果。
由于造纸废水含有大量的难生物降解物质，制浆造纸废水的生化处理效率较低，随着制 浆造纸废水的排放标准的提标，能够有效地去除制浆造纸废水中的COD、BOD和有毒物质 变得至关重要，通过生化系统中复合菌群的构建，可以有效提高BOD和COD的降解、减少 后续物化系统的化学品的投加及运行费用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种造纸废水中的有机物降解效率高，成 本低的用于降解造纸废水的复合菌群及其制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于降解造纸废水的复合菌群的制备方法，包括如下步骤：
(1)五种细菌对数生长期细胞的制备：分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状 菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆菌(Enterobacter.cloacae.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)， 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)五种菌1～2环，将其分别转移到含20～50mL营养液中， 每种细菌在27～35℃的条件下培养1～2天，再将培养后的五种菌按菌体与增殖培养基体积比分 别以1:9～1:12的体积比例接种至含300～500mL增殖培养基的容器中，采用不同的增殖培养基 培育。其中，土壤杆菌、杆状菌和阴沟肠杆菌的营养培养基为牛肉膏1.5g～2.0/L，葡萄糖1.0～2.0 g/L，胰蛋白胨6.0～7.0g/L，酵母粉3.0～4.0g/L，其余为水;施氏假单胞菌和恶臭假单胞菌营 养培养基为新鲜马铃薯汁800～1000mL，葡萄糖16～20g，其余为水(马铃薯汁的制备方法： 取去皮新鲜马铃薯160～200克，切成小块，加去离子水800～1000mL煮沸30分钟，滤去马铃薯 块，用去离子水将滤液补足至800～1000mL)。然后在27～35℃的条件下培养1～2天，以 6000～7000rpm的速度离心10～15min后，分别获得上述五种菌体的对数生长期细胞。所述营 养液主要成分为牛肉膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L，酵母粉3.0～4.0 g/L，pH6.5～7.5，其余为水;
(2)五种菌体的混合菌群的复配：将所述五种菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐 缓冲液洗涤2～3次后，按体积百分比计，分别取5～8%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，2～5% 杆状菌(Bacillus sp.)，10～15%阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，26～41%恶臭假单胞 菌(Pseudomonas putida)和34～56%施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)混合;得用于 降解造纸废水的复合菌群。
优选地，所述复合菌群降解造纸废水时，取复合菌群的混合菌液以1:15～1:30的体积比 例投加到营养液中进行培养6～12h，使复合菌群活化后直接投入到造纸废水中，每1升造纸 废水加入混合菌液1～2mL;曝气处理2～4d，曝气量为2～4L/h。所述营养液主要成分为牛肉 膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L，酵母粉3.0～4.0g/L，pH6.5～7.5， 其余为水。
按体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠8.0～9.0g/L，氯化钾0.2～0.3g/L，磷 酸氢二钾1.1～1.2g/L和磷酸二氢钾0.2～0.3g/L，其余为水。
所述磷酸盐缓冲液的洗涤次数为2～3次。
一种用于降解木质素的复合菌群，由上述制备方法制得。
本发明具有如下优点：
1)本发明提供的利用土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆 菌(Enterobacter.Cloacae.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)，施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri.)五种菌按一定比例组成优势复合菌群投加进行废水的生物强化处 理：恶臭假单胞菌经常被用于废水处理，它有降解芳香烃类例如甲苯和苯酚的能力，这些都 是城市废水中的常见污染物;杆状菌是一种常见的土壤细菌并能使芳香烃产生二次降解，并 且对五氯酚、多溴联苯醚等芳香族有机污染物具有一定的降解作用;而土壤杆菌是从土壤中 分离出来菌种，对于土壤中的多数有机物污染物和重金属等污染物均有一定的降解作用。本 发明发现复合菌群的降解效果远高于任何一株单一菌株，说明不同微生物之间产生一定的 相互作用。这是由于不少生物活动是单株微生物所不能完成或只能微弱进行的，必须借助 两种或多种微生物在同一环境中的相互作用来实现。采用单一菌群和基因工程菌进行污染 物降解过程中，常常由于抑制性中间代谢产物的生成或中间产物进入截止式代谢产物途径 (end product pathways)而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降解不彻 底。利用微生物间有益的相互作用，将微生物混合培养与驯化，将细菌对污染物的中间代 谢产物流向进行某些改进，使抑制性中间产物不生成或尽快转化，从而提高污染物降解效 率。因此，利用微生物相互作用，在微生物的实际应用中所采用的混合细菌微生物培养驯 化法更具有重要意义。
2)在本发明中，我们发现从受电子垃圾污染的土壤中分离出来的土壤杆菌和杆状菌都 能产生烟酸羟基化酶和环开裂加双氧酶等，施氏假单胞菌则能产生木质均二苯代乙稀‐α,β‐ 加双氧酶等过氧化物酶。这些酶能够对造纸废水多种芳香族化合物具有很强的降解作用。尤 其对于造纸废水中含量最大的木质素具有很好的降解作用。这些酶能同时进攻木质素结构中 的醚键、C‐C键和Cα‐Cβ双键，使木质素结构迅速得到破坏，生成分量子较低的芳香族化合物 (如香草醛、香草酸和醌类物质)、粘康酸酯以及部分小分子羧酸(甲酸)等物质。这些有 机酸的生成会使系统的pH值逐渐降低，从而抑制上述三种菌的生长代谢，导致酶活性降 低。而添加的恶臭假单胞菌和阴沟肠杆菌则能快速利用造纸废水中大分子有机物降解生成的 小分子有机酸进行生长代谢，并进一步将其降解成二氧化碳和水等无机物，使系统的pH值 得到恢复，从而使抑制作用得到消除，达到持续高效去处造纸废水中COD、BOD和SS的目 的。由于各不同的菌株之间的互补和协同作用，它们联合作用就对造纸废水中的有机物具 有很高的降解率。