申请日2013.11.11
公开(公告)日2014.03.12
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12R1/07; C02F103/28; C12R1/38; C12R1/01; C12R1/40
摘要
本发明公开了一种用于降解木质素废水的复合菌群及其制备方法。该方法先分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆菌(Enterobacter.cloacae.)，戈登氏菌(Gordonia sp.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)接种培养;按体积百分比计，分别取3～6%土壤杆菌，3～7%杆状菌，10～26%阴沟肠杆菌，34～45%戈登氏菌，16～38%恶臭假单胞菌和12～23%施氏假单胞菌活化后，混合投入到废水中。本发明通过菌种间的协调作用，能有效提高微生物处理木质素的降解效率。
权利要求书
1.一种用于降解木质素废水的复合菌群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)六种细菌对数生长期细胞的制备：分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状 菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆菌(Enterobacter.cloacae.)，戈登氏菌(Gordonia sp.)，恶臭假 单胞菌(Pseudomonas putida.)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)六种菌1～2环，将 其分别转移到含20～50mL营养液中，每种细菌在27～35℃的条件下培养1～2天，再将培养 后的六种菌按菌体与增殖培养基体积比分别以1:9～1:12的比例接种至含300～500mL增殖培 养基的容器中，采用不同的增殖培养基培育，其中，土壤杆菌、杆状菌和阴沟肠杆菌的增 殖培养基为牛肉膏3.0～4.0g/L，胰蛋白胨5.0～6.0g/L，其余为水;戈登氏菌营养增殖基为葡 萄糖8.0～10.0g/L，酵母粉8.0～10.0g/L，其余为水;恶臭假单胞菌增殖培养基为牛肉膏 1.5g～2.0/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨6.0～7.0g/L，酵母粉3.0～4.0g/L，其余为水;施 氏假单胞菌的增殖培养基为酪蛋白17.0～20.0g/L，磷酸氢钾2.5～3.0g/L，葡萄糖2.0～3.0g/L， 大豆粉3.0～4.0g/L，氯化钠4.0～5.0g/L，其余为水;然后在27～35℃的条件下培养1～2天， 以6000～7000rpm的速度离心10～15min后，分别获得上述六种菌体的对数生长期细胞; 所述营养液主要成分为牛肉膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L，酵母 粉3.0～4.0g/L，pH6.5～7.5，其余为水;
(2)六种菌体的混合菌群的复配：将所述六种菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐 缓冲液洗涤后，分别取3～6%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，3～7%杆状菌(Bacillus sp.)， 10～26%阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，24～35%戈登氏菌(Gordonia)，16～38%恶 臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和12～23%施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)混合; 得用于降解木质素废水的复合菌群。
2.根据权利要求1所述的用于降解木质素废水的复合菌群的制备方法，其特征在于， 所述复合菌群降解含木质素废水时，取复合菌群的混合菌液以1:15～1:30的体积比例投加到 营养液中进行培养6～12h，使复合菌群活化后直接投入到含木质素的废水中，每1升含木 质素的废水加入混合菌液1～2mL;曝气处理3～5d，曝气量为2～4L/h。
3.根据权利要求2所述的用于降解木质素废水的复合菌群的制备方法，其特征在于， 所述营养液主要成分为牛肉膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L，酵母 粉3.0～4.0g/L，pH6.5～7.5，其余为水。
4.根据权利要求1所述的用于降解木质素废水的复合菌群的制备方法，其特征在于， 按体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠8.0～9.0g/L，氯化钾0.2～0.3g/L，磷酸 氢二钾1.1～1.2g/L和磷酸二氢钾0.2～0.3g/L，其余为水。
5.根据权利要求1或3所述的用于降解木质素废水的复合菌群的制备方法，其特征在 于，所述磷酸盐缓冲液的洗涤次数为2～3次。
6.一种用于降解木质素废水的复合菌群，其特征在于，由权利要求1、4或5所述制 备方法制得。
说明书
一种用于降解木质素废水的复合菌群及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种木质素废水处理，具体涉及一种用于降解木质素废水的复合菌群及其 制备方法。
背景技术
生物处理是当前常用的废水处理方法，这种方法通过微生物的新陈代谢作用，将废水中 的污染物质分解、吸收，从而达到治理污染的目的。生物处理法与其他方法相比，其成本低， 效率高，而且容易操作，最重要的是没有二次污染，因此，在废水处理中得到了广泛的应用。 随着经济的发展，废水的成分日益复杂，尤其当废水中含有有毒、难降解的有机污染物时， 由于对该类有机物具有专项降解能力的微生物在环境中的种类、数量较少，同时它在种间竞 争中处于劣势，因此，传统的生物处理技术面临极大挑战。
由于木质素的难生物降解性，制浆造纸废水的生化处理效率较低，随着制浆造纸废水的 排放标准的提标，能够有效地去除制浆造纸废水中的COD、BOD和有毒物质变得至关重要， 如何有效提高BOD和COD的降解、减少后续物化系统的化学品的投加及运行费用成为现有 技术急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种木质素的降解效率高，费用低的用 于降解木质素废水的复合菌群及其制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于降解木质素废水的复合菌群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)六种细菌对数生长期细胞的制备：分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状 菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆菌(Enterobacter.Cloacae.)，戈登氏菌(Gordonia sp.)，恶臭假 单胞菌(Pseudomonas putida.)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)六种菌1～2环，将 其分别转移到含20～50mL营养液中，每种细菌在27～35℃的条件下培养1～2天，再将培养 后的六种菌按菌体与增殖培养基体积比分别以1:9～1:12的比例接种至含300～500mL增殖培 养基的容器中，采用不同的增殖培养基培育，其中，土壤杆菌、杆状菌和阴沟肠杆菌的增殖 培养基为牛肉膏3.0～4.0g/L，胰蛋白胨5.0～6.0g/L，其余为水;戈登氏菌营养增殖基为葡萄 糖8.0～10.0g/L，酵母粉8.0～10.0g/L，其余为水;恶臭假单胞菌增殖培养基为牛肉膏1.5g～2.0 /L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨6.0～7.0g/L，酵母粉3.0～4.0g/L，其余为水;施氏假单胞 菌的增殖培养基为酪蛋白17.0～20.0g/L，磷酸氢钾2.5～3.0g/L，葡萄糖2.0～3.0g/L，大豆粉 3.0～4.0g/L，氯化钠4.0～5.0g/L，其余为水;然后在27～35℃的条件下培养1～2天，以6000～7000 rpm的速度离心10～15min后，分别获得上述六种菌体的对数生长期细胞;所述营养液主要 成分为牛肉膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L，酵母粉3.0～4.0g/L， pH6.5～7.5，其余为水;
(2)六种菌体的混合菌群的复配：将所述六种菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐 缓冲液洗涤后，分别取3～6%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，3～7%杆状菌(Bacillus sp.)， 10～26%阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，24～35%戈登氏菌(Gordonia)，16～38%恶臭 假单胞菌(Pseudomonas putida)和12～23%施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)混合;得 用于降解木质素废水的复合菌群。
所述复合菌群降解含木质素废水时，取复合菌群的混合菌液以1:15～1:30的体积比例投 加到营养液中进行培养6～12h，使复合菌群活化后直接投入到含木质素的废水中，每1升含 木质素的废水加入混合菌液1～2mL;曝气处理3～5d，曝气量为2～4L/h。
所述营养液主要成分为牛肉膏1.5～2.0g/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨5.5～6.5g/L， 酵母粉3.0～4.0g/L，pH6.5～7.5，其余为水。
按体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠8.0～9.0g/L，氯化钾0.2～0.3g/L， 磷酸氢二钾1.1～1.2g/L和磷酸二氢钾0.2～0.3g/L，其余为水。所述磷酸盐缓冲液的洗涤次数 为2～3次。
一种用于降解木质素废水的复合菌群，由上述制备方法制得。
所述步骤(3)中木质素废水为自制的模拟废水。由于本发明主要是针对造纸废水中木 质素的降解菌群的开发，同时为了更好的研究复合菌群对木质素的降解情况，故本实施例中 采用自制的模拟废水。上述自制的木质素模拟废水其制备方法如下：准确称取200～500mg 的木质素加入到1L的无菌无机盐培养基中，搅拌30～60min后将pH调节至6.0～9.0。其中配 制废水的溶液为无菌无机盐培养基，其主要成分为CaCl20.01～0.02g/L，KH2PO42.0～2.5g/L， MgSO40.25～0.30g/L，酒石酸铵0.5～0.6g/L，NH4NO30.5～0.6g/L，其余为水。上述制得的废 水中木质素的浓度为200～500mg/L，pH6.0～9.0。
本发明具有如下优点：
1)本发明提供的利用土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)，阴沟肠杆 菌(Enterobacter.Cloacae.)，戈登氏菌(Gordonia sp.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)， 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri.)六种菌按一定比例组成优势复合菌群投加进行废水的 生物强化处理：恶臭假单胞菌经常被用于废水处理，它有降解芳香烃类例如甲苯和苯酚的能 力，这些都是城市废水中的常见污染物;杆状菌是一种常见的土壤细菌并能使芳香烃产生二 次降解，并且对五氯酚、多溴联苯醚等芳香族有机污染物具有一定的降解作用;戈登氏菌是 一种石油降解菌，它能将正十六烷，苯，萘，蒽，菲作为碳源和能量来源;而土壤杆菌是从 土壤中分离出来菌种，对于土壤中的多数有机物污染物和重金属等污染物均有一定的降解作 用。本发明发现复合菌群的降解效果远高于任何一株单一菌株，说明不同微生物之间产生 一定的相互作用。这是由于不少生物活动是单株微生物所不能完成或只能微弱进行的，必 须借助两种或多种微生物在同一环境中的相互作用来实现。采用单一菌群和基因工程菌进 行污染物降解过程中，常常由于抑制性中间代谢产物的生成或中间产物进入截止式代谢产 物途径(end product pathways)而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降 解不彻底。利用微生物间有益的相互作用，将微生物混合培养与驯化，将细菌对污染物的 中间代谢产物流向进行某些改进，使抑制性中间产物不生成或尽快转化，从而提高污染物 降解效率。因此，利用微生物相互作用，在微生物的实际应用中所采用的混合细菌微生物 培养驯化法更具有重要意义。
2)本发明发现从受电子垃圾污染的土壤中分离出来的土壤杆菌和杆状菌都能产生烟酸 羟基化酶和环开裂加双氧酶等，而施氏假单胞菌则能产生木质均二苯代乙稀‐α,β‐加双氧酶等 过氧化物酶。这些酶能够同时攻击木素结构中的醚键、C‐C键和Cα‐Cβ双键，使木素结构迅速 得到破坏，生成分量子较低的芳香族化合物(如香草醛、香草酸和醌类物质)、粘康酸酯以 及部分小分子羧酸(甲酸)等物质。这些有机酸的生成会使系统的pH值逐渐降低，从而抑 制上述三种菌的生长代谢，导致酶活性降低。而添加的恶臭假单胞菌、阴沟肠杆菌和戈登 氏菌则能快速利用木素降解生成的小分子有机酸进行生长代谢，并进一步将其降解成二氧化 碳和水等无机物，使系统的pH值得到恢复，从而使抑制作用得到消除。由于各不同的菌株 之间的互补和协同作用，它们联合作用就对木质素具有很高的降解率。