申请日2013.11.11
公开(公告)日2014.03.19
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C02F101/38; C12R1/40; C12R1/01; C12R1/07
摘要
本发明公开了一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群及其制备方法。该制备方法先分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)、戈登氏菌(Gordonia)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，接种培养;按体积百分比计，分别取2～5%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，10～15%杆状菌(Bacillus sp.)，48～58%戈登氏菌(Gordonia)和16～35%恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)混合;得用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群;应用时，优势菌群活化后，混合投入到废水中即可。本发明通过菌种间的协调作用，能显著提高了微生物处理十溴联苯醚废水的降解效率。
权利要求书
1.一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)四种细菌对数生长期细胞的制备：
分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)、戈登氏菌(Gordonia)、 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)四种细菌的1～2环，将其分别转移到含20～50mL营养 液中，每种细菌在27～35℃的条件下培养1～2天;再将培养后的四种菌分别以1:9～1:12体积比 例接种至含300～500mL无菌增殖培养基的容器中，采用不同的增殖培养基培育，其中，土 壤杆菌(Agrobacterium sp.)和杆状菌(Bacillus sp.)采用营养肉汤，以浓度计，其组成为： 牛肉膏3.0～4.0g/L，胰蛋白胨4.0～5.0g/L;戈登氏菌(Gordonia)采用酵母膏葡萄糖培养基， 其组成为：葡萄糖8.0～10.0g/L，酵母膏8.0～10.0g/L，其余为水;恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)采用细菌培养基，其组成为：牛肉膏1.5g～2.0/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨 6.0～7.0g/L，酵母粉3.0～4.0g/L，其余为水;然后在27～35℃的条件下培养1～2天，以6000～7000 rpm的速度离心10～15min后，分别获得四种菌体的对数生长期细胞;所述营养液的主要成 分为1.5～2.0g/L牛肉膏，1.0～2.0g/L葡萄糖，5.5～6.5g/L胰蛋白胨，3.0～4.0g/L酵母粉;pH值 为6.0～8.0，其余为水;
(2)四种菌体的混合菌群的培养：
将所述四种菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐缓冲液洗涤后，按体积百分比计， 分别取2～5%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，10～15%杆状菌(Bacillus sp.)，48～58% 戈登氏菌(Gordonia)和16～35%恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)混合;得用于降 解十溴联苯醚废水的优势菌群。
2.根据权利要求1所述的用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群的制备方法，其特征 在于，所述优势菌群降解含十溴联苯醚废水时，取优势菌群的混合菌液与培育营养液以 1:15～1:30的体积比例投加到培育营养液中进行培养6～12h，使优势菌群活化后直接投入到 含十溴联苯醚的废水中，每1升含十溴联苯醚的废水加入混合菌液1～2mL;曝气处理7～10 d，曝气量为2～4L/h。
3.根据权利要求2所述的用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群的制备方法，其特征 在于，所述培育营养液的主要成分为1.5～2.0g/L牛肉膏，1.0～2.0g/L葡萄糖，5.5～6.5g/L 胰蛋白胨，3.0～4.0g/L酵母粉;pH值为6.0～8.0，其余为水。
4.根据权利要求1所述的用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群的制备方法，其特征在 于，按体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠8.0～9.0g/L，氯化钾0.2～0.3g/L， 磷酸氢二钾1.1～1.2g/L和磷酸二氢钾0.2～0.3g/L，其余为水。
5.根据权利要求1或3所述的用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群的制备方法，其特 征在于，所述磷酸盐缓冲液的洗涤次数为2～3次。
6.一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群，其特征在于，由权利要求1、4或5所 述制备方法制得。
说明书
一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群及其制备方法
技术领域
本发明涉及十溴联苯醚废水处理领域，具体是一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群 及其制备方法。
背景技术
生物处理是当前常用的废水处理方法，这种方法通过微生物的新陈代谢作用，将废水中 的污染物质分解、吸收，从而达到治理污染的目的。生物处理法与其他方法相比，其成本低， 效率高，而且容易操作，最重要的是没有二次污染，因此，在废水处理中得到了广泛的应用。 随着经济的发展，废水的成分日益复杂，尤其当废水中含有有毒、难降解的有机污染物时， 由于对该类有机物具有专项降解能力的微生物在环境中的种类、数量较少，同时它在种间竞 争中处于劣势，因此，传统的生物处理技术面临极大挑战。如果在传统的生物处理体系中投 加具有特定功能的微生物或某些基质，增强它对特定污染物的降解能力，从而改善整个污水 处理体系的处理效果，我们称这种技术为生物强化技术。
生物强化技术中投加的微生物可以来源于原有处理体系，经过驯化、富集、筛选、培养， 从而达到一定数量的微生物，也可以是原来不存在的外源微生物或遗传工程菌。其中优势菌 种在系统中的稳定性是决定生物强化运行的关键所在。我们前期研究表明经过统计学方法可 以研究微生物种群间的相互作用，筛选组成微生物优势种群，其生物强化作用优于单一菌种 的生物强化效果。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群 及其制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群的制备方法，包括如下步骤：
(1)四种细菌对数生长期细胞的制备：
分别挑取土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)、戈登氏菌(Gordonia)、 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)四种细菌的1～2环，将其分别转移到含20～50mL营养液 中，每种细菌在27～35℃的条件下培养1～2天;再将培养后的四种菌分别以1:9～1:12体积比例 接种至含300～500mL无菌增殖培养基的容器中，采用不同的增殖培养基培育，其中，土壤杆 菌(Agrobacterium sp.)和杆状菌(Bacillus sp.)采用营养肉汤，以浓度计，其组成为：牛肉 膏3.0～4.0g/L，胰蛋白胨4.0～5.0g/L;戈登氏菌(Gordonia)采用酵母膏葡萄糖培养基，其组 成为：葡萄糖8.0～10.0g/L，酵母膏8.0～10.0g/L，其余为水;恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) 采用细菌培养基，其组成为：牛肉膏1.5g～2.0/L，葡萄糖1.0～2.0g/L，胰蛋白胨6.0～7.0g/L， 酵母粉3.0～4.0g/L，其余为水;然后在27～35℃的条件下培养1～2天，以6000～7000rpm的速度 离心10～15min后，分别获得四种菌体的对数生长期细胞;所述营养液的主要成分为1.5～2.0 g/L牛肉膏，1.0～2.0g/L葡萄糖，5.5～6.5g/L胰蛋白胨，3.0～4.0g/L酵母粉;pH值为6.0～8.0， 其余为水;
(2)四种菌体的混合菌群的培养：
将所述四种菌体的对数生长期细胞取出，用磷酸盐缓冲液洗涤后，按体积百分比计， 分别取2～5%土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，10～15%杆状菌(Bacillus sp.)，48～58% 戈登氏菌(Gordonia)和16～35%恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)混合;得用于降解 十溴联苯醚废水的优势菌群。
进一步地，所述优势菌群降解含十溴联苯醚废水时，取优势菌群的混合菌液与培育营养 液以1:15～1:30的体积比例投加到培育营养液中进行培养6～12h，使优势菌群活化后直接投 入到含十溴联苯醚的废水中，每1升含十溴联苯醚的废水加入混合菌液1～2mL;曝气处理 7～10d，曝气量为2～4L/h。
所述培育营养液的主要成分为1.5～2.0g/L牛肉膏，1.0～2.0g/L葡萄糖，5.5～6.5g/L胰蛋 白胨，3.0～4.0g/L酵母粉;pH值为6.0～8.0，其余为水。
按体积百分比计，所述磷酸盐缓冲液的成分为氯化钠8.0～9.0g/L，氯化钾0.2～0.3g/L，磷 酸氢二钾1.1～1.2g/L和磷酸二氢钾0.2～0.3g/L，其余为水。
所述磷酸盐缓冲液的洗涤次数为2～3次。
一种用于降解十溴联苯醚废水的优势菌群，由上述制备方法制得。
本发明具有如下优点：
1)本发明提供的利用土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)，戈登氏菌 (Gordonia)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)四种菌按一定比例组成优势菌群投加进 行废水的生物强化处理：恶臭假单胞菌经常被用于废水处理，它有降解芳香烃类例如甲苯和 苯酚的能力;杆状菌是一种常见的土壤细菌并能使芳香烃产生二次降解，并且对五氯酚、多 溴联苯醚等芳香族持久性有机污染物具有一定的降解作用;戈登氏菌是一种石油降解菌，它 能将正十六烷，苯，萘，蒽，菲作为碳源和能量来源，而土壤杆菌是从土壤中分离出来菌种， 对于土壤中的多数有机物污染物和重金属等污染物均有一定的降解作用。本发明发现优势菌 群对十溴联苯醚的降解效果远高于任何一株单一菌株，说明不同微生物之间产生一定的相 互作用。这是由于不少生物活动是单株微生物所不能完成或只能微弱进行的，必须借助两 种或多种微生物在同一环境中的相互作用来实现。采用单一菌群和基因工程菌进行污染物 降解过程中，常常由于抑制性中间代谢产物的生成或中间产物进入截止式代谢产物途径 (end product pathways)而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降解不彻 底。利用微生物间有益的相互作用，将微生物混合培养与驯化，将细菌对污染物的中间代 谢产物流向进行某些改进，使抑制性中间产物不生成或尽快转化，从而提高污染物降解效 率。因此，利用微生物相互作用，在微生物的实际应用中所采用的混合细菌微生物培养驯 化法更具有重要意义。
2)在本发明中，我们发现从受电子垃圾污染的土壤中分离出来的土壤杆菌 (Agrobacterium sp.)，杆状菌(Bacillus sp.)都能产生烟酸羟基化酶和环开裂加双氧酶等， 这些酶能对废水中含有的十溴联苯醚具有良好的降解作用，能将其降解生成低溴代的联苯 醚(四、五和六溴代联苯醚)甚至是低分子量的有机物。然而由于这些低溴代的联苯醚生 物毒性增强，其浓度的增加会对上述两种菌的代谢活动产生严重的抑制作用，导致烟酸羟 基化酶和环开裂加双氧酶等酶的活性降低。恶臭假单胞菌和戈登式菌可以将低溴代的联苯 醚降解生成毒性更低的低溴代联苯醚(一、二和三溴代联苯醚)甚至是无毒的二苯醚和小 分子有机物。随着高毒性多溴联苯醚的降解，土壤杆菌和杆状菌的代谢活动又恢复正常， 进而继续分泌大量的烟酸羟基化酶和环开裂加双氧酶，实现对十溴联苯醚的降解。在这个系 统中，微生物的生长底物之间没有竞争性，烟酸羟基化酶和环开裂加双氧酶等酶的活性不 会受到抑制，能够实现对十溴联苯醚的持续降解。由于各不同的菌株之间的互补和协同作 用，它们联合作用就对十溴联苯醚具有很高的降解率。