申请日2013.03.03
公开(公告)日2014.09.03
IPC分类号C05F11/08
摘要
本发明涉及一种酵母废水资源化利用生产多功能生物有机肥的方法，属于高浓度废水资源化利用和生物有机肥技术领域。本发明采用的菌株是从土壤中分离筛选出来的一株高效植物促生菌——地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)B4菌株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.6677。本发明利用酵母废水作为发酵培养基，大规模培养地衣芽孢杆菌，制备具有防治植物病害、促进植物生长的生物有机肥，该工艺生产成本低廉，操作简单，还可以使酵母废水得到资源化利用，减少污染排放。本发明生产的生物有机肥用于蔬菜的生产，不仅可以提高产量，而且可以改善茶园和蔬菜的品质，显示出广阔的应用前景。
权利要求书
1.一种利用酵母废水生产地衣芽孢杆菌生物有机肥的方法，包括如下步骤：
(1)酵母废水预处理：用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节酵母废水的pH到7.0～8.0，于110～121℃灭菌10～30分钟;
(2)液体种子制备：向装有预处理好的酵母废水的三角瓶中接种斜面保藏的地衣芽孢杆菌，于25～37℃，120～200转/分振荡培养24～36小时，得到液体种子;
(3)液态发酵：向装有预处理好的酵母废水发酵罐中接种体积比为2%～15%的液体种子，于25～37℃，通无菌空气培养15～36小时;培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到9×108 CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂稀释后使用;
(4)生物有机肥的制备：以充分腐熟的有机肥为载体，按照发酵液∶有机肥为1∶3 ～ 1∶10的重量比，将发酵液添加到有机肥中，充分混合均匀，通风干燥至含水量30%以下，即得到地衣芽胞杆菌生物有机肥，包装，存放在阴凉干燥处，备用。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌生物有机肥的使用方法，包括：
(1)将发酵液用灌溉用水稀释到活菌数为2×106 CFU/毫升～5×107 CFU/毫升，混合均匀，按照每亩1～3立方米稀释液的用量沟施入作物根部附近的土壤中;
(2)将地衣芽孢杆菌生物有机肥按照每亩0.5～3吨的用量作为基肥施入土壤中，或在作物生长期内，追肥施用。
3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其特征在于：该地衣芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 6677。
说明书
酵母废水资源化生产多功能生物有机肥
技术领域
本发明涉及一种酵母废水资源化利用生产多功能生物有机肥的方法，该生物有机肥具有拮抗植物病害、促进植物生长和改善作物品质的功能，属于高浓度废水资源化利用和生物有机肥技术领域。
背景技术
酵母是一种单细胞真核微生物，它是人类文明史上应用得最早的微生物。目前，酵母广泛应用在食品、酿酒、医药、化妆品、饲料等行业。近年来，随着我国制药业和食品业的迅速发展，酵母工业也随之飞速发展，国内活性干酵母产量已经超过20万吨/年。我国现有较大规模的酵母生产公司主要有安琪、马利、丹宝利、奥力、明光等。这些生产企业正在由小变大，生产技术和装备水平稳步提高，利润大幅度增加，企业正在向着专业化、大型化、集团化方向发展。我国主要是利用废糖蜜(甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜)作为酵母的生长碳源，并以硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、磷酸铵等作营养盐生产酵母。由于酵母不能充分利用废糖蜜中的有机物质，剩余的有机物质以及酵母在生长代谢过程中产生的新的有机物都进入到废水中，产生大量的高浓度的且难以降解的酵母废水，每生产1吨干酵母产生60~130 m3的废水。随着酵母工业的快速发展，酵母废水对环境的污染问题日益突出，已成为制约国内酵母企业发展的瓶颈。
酵母废水主要是来源于酵母发酵过程离心分离及过滤装置排放的高浓度废水，一般为20t/t酵母。COD在30000～80000mg/L，总氮500～1500mg/L，硫酸盐2000mg/L，pH 4.0～7.5。主要成份为酵母蛋白质、纤维素、胶体物质，以及未被充分利用废糖蜜中的营养成分，如残糖等，除了高有机物含量，酵母废水中的焦糖化合物使得酵母废水颜色较深，为深褐色;同时酵母废水中还含有发酵过程中的微生物代谢产物、无机盐类、硫酸根浓度均较高，导致了废水处理达标排放非常困难，处理成本高昂;如果处理不当，容易造成严重的环境污染。目前科研人员研发了多种处理酵母废水的工艺，以期提高处理效率，降低处理成本，例如：中国发明专利(申请号：200710053598.0)中公开了一种酵母废水深度处理的方法，先经生化处理，再依次加入无机絮凝剂和有机絮凝剂，最后通过活性炭脱色。中国发明专利(申请号：200910114686.6)中公开了一种酵母废水处理方法，首先将废水进行混凝沉淀预处理;再将预处理后的废水依次进行厌氧处理和好氧处理，最后采用芬顿高级氧化法及气浮进行深度氧化处理。中国发明专利(申请号：200910212384.2)中公开了一种酵母高浓度有机废水处理方法，主要是将高浓度酵母废水蒸发浓缩，获得浓度为40%-80%的浓缩液，蒸发浓缩过程能源消耗较大。中国发明专利(申请号：201110457764.X)中公开了一种高浓度酵母废水的处理系统及方法，主要通过厌氧生物反应器发酵沼气，回收能源，但是厌氧发酵后的废水中污染物浓度仍然很高，还需要后续处理。可见，开发简便易行并且经济效益好的酵母废水资源化利用技术仍然是一项非常紧迫的任务。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)在自然界中分布广泛，是一种重要的生防菌，它通过产生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物质来抑制植物病原细菌、真菌、病毒、线虫，从而起到生物防治的作用;同时它也是一类重要的植物根际促生细菌，表现出对多种植物促进生长的作用。例如，中国发明专利(申请号：200310115535.5)中公开了一株地衣芽孢杆菌B-0A12菌株，保藏编号为CGMCC No. 1035，用于防治大豆胞囊线虫病和镰刀菌引起的根腐病，该菌株发酵培养过程中使用的培养基为：可溶性淀粉1-2%，豆饼粉1-2%，牛肉膏0.5-1.0%，葡萄糖0.1-0.5%，还有少量无机盐，发酵结束时细菌含量为7×108个/毫升。中国发明专利(申请号：200810026137.9)中公开了一株植物内生地衣芽孢杆菌R21菌株，保藏编号为CCTCC M 207113，具有广谱拮抗植物病原真菌能力、解磷能力和促进植物生长能力，其发酵采用了LB培养基，并公开了其防治西芹黄萎病、香蕉枯萎病，以及促进西芹生长方面的应用。中国发明专利(申请号：200810183072.9)中公开了一株地衣芽孢杆菌201菌株，保藏编号为CCTCC No. M207092，该菌株对香蕉枯萎病、西瓜枯萎病、番茄枯萎病、香蕉炭疽病、小麦赤霉病等多种病原真菌具有拮抗作用，该菌株的培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。中国发明专利(申请号：200810183075.2)中公开了一株地衣芽孢杆菌202菌株，保藏编号为CCTCC No. M207093，它也具有与201菌株类似的生防功能。
地衣芽孢杆菌在工业上的应用也比较广泛。例如，中国发明专利(申请号：200810227858.6)中公开了一株地衣芽孢杆菌U1-3菌株，保藏编号为CGMCC No. 2437，该菌株在采油工程领域中可以用来驱油，提高石油采收率，其培养基采用了液体石蜡、酵母粉和多种无机盐。中国发明专利(申请号：200810055068.4)中公开了一株地衣芽孢杆菌WX-02菌株，保藏编号为CCTCC No. M208065，用于生产聚γ-谷氨酸，其培养基采用了谷氨酸钠，碳源(淀粉或淀粉水解液、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖中的一种)，无机氮源和其他多种无机盐。中国发明专利(申请号：200810026812.8)中公开了一株地衣芽孢杆菌HM-3菌株，保藏编号为CGMCC No. 1970，用于生产碱性蛋白酶，培养基采用了酵母膏、蛋白胨和城市污泥。中国发明专利(申请号：200610053548.8)中公开了一株地衣芽孢杆菌B-05571菌株，保藏编号为CCTCC No. M206082，用于将甘油转化为二羟基丙酮，培养基以甘油为主要碳源，还有酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、多种无机盐。
综上所述，具有拮抗植物病害的地衣芽孢杆菌的菌株较多，其培养方法也各不相同，但是，未见采用酵母废水培养地衣芽孢杆菌并将其用于生产生物有机肥的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够资源化利用酵母废水生产高效拮抗植物病原菌、促进植物生长和改善作物品质的地衣芽孢杆菌生物有机肥的方法。
本发明所使用的菌株是由发明人从土壤中分离筛选出来的一株高效促进植物生长、拮抗植物病原菌、提高作物品质的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)B4菌株，该菌株于2012年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 6677，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明所述的多功能生物有机肥的生产方法如下：
1、酵母废水预处理：用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节酵母废水的pH到7.0～8.0，于110～121℃灭菌10～30分钟。
2、液体种子制备：向装有预处理好的酵母废水的三角瓶中接种斜面保藏的地衣芽孢杆菌，于25～37℃，120～200转/分振荡培养24～36小时，得到液体种子。
3、液态发酵：向装有预处理好的酵母废水发酵罐中接种体积比为2%～15%的液体种子，于25～37℃，通无菌空气培养15～36小时;培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到9×108 CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂稀释后使用。
4、生物有机肥的制备：以充分腐熟的有机肥为载体，按照发酵液∶有机肥为1∶3 ～ 1∶10的重量比，将发酵液添加到有机肥中，充分混合均匀，通风干燥至含水量30%以下，即得到地衣芽胞杆菌生物有机肥，包装，存放在阴凉干燥处，备用。
本发明所述的地衣芽孢杆菌多功能生物有机肥的使用方法如下：
1、将发酵液用灌溉用水稀释到活菌数为2×106 CFU/毫升～5×107 CFU/毫升，混合均匀，按照每亩1～5立方米稀释液的用量沟施入作物根部附近的土壤中;
2、将地衣芽孢杆菌生物有机肥按照每亩0.5～3吨的用量作为基肥施入土壤中，或在作物生长期内，追肥施用。
具体实施方式：
由本发明提供的地衣芽孢杆菌生防菌剂能有效防治多种土传植物病害，并能够促进作物对养分的吸收和利用，还能提供一定量的钾肥;本发明提供的技术方案生产的农用微生物菌剂应用于农业生产可以减少化肥和农药的使用量，从而改善农田环境质量;而且生产成本很低，使高浓度废水得到资源化利用，减少污染物排放。具体实施方式如下：
实施例1：酵母废水生产地衣芽孢杆菌生物有机肥
酵母废水预处理：用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节废水的pH到7.5左右，于115℃灭菌15分钟。
液体种子制备：液体种子制备：向装有预处理好的酵母废水的三角瓶中接种斜面保藏的地衣芽孢杆菌，于35℃，150转/分振荡培养24小时，得到液体种子。
液态发酵：向装有预处理好的酵母废水发酵罐中接种体积比为5%的液体种子，于35℃，通无菌空气培养20小时;培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到9×108 CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂稀释后使用。
生物有机肥的制备：以充分腐熟的有机肥为载体，按照发酵液∶有机肥为1∶5的重量比，将发酵液添加到有机肥中，充分混合均匀，通风干燥至含水量30%以下，即得到地衣芽胞杆菌生物有机肥，包装，存放在阴凉干燥处，备用。
实施例2：地衣芽孢杆菌生物有机肥用于防止黄瓜猝倒病
黄瓜猝倒病是由真菌侵染引起的病害。采集多年种植黄瓜的温室大棚中的土壤，接种瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)，混合均匀，装入花盆中，设置2组花盆，每组10盆，至于15℃～20℃的温室中，保持较高湿度和较低的光照强度。第1组花盆直接播种黄瓜种子，每盆15粒，作为对照。第2组播种黄瓜种子前向土壤中拌入重量比为0.3%的地衣芽孢杆菌生防菌剂，然后每盆播种15粒种子。幼苗出土后统计总数，幼苗长出1片真叶后，2片真叶前统计倒伏苗总数。结果表明，对照幼苗倒伏率超过65%，而添加菌剂的实验组，幼苗倒伏率低于10%。
实施例3：地衣芽孢杆菌生物有机肥用于提高蔬菜的产量和改善蔬菜的品质
采用蔬菜大棚小区实验，设置8个条件完全相同的实验小区，每个小区60 m2，2个小区为1组平行试验，共分成4组，种植小油菜，在小油菜幼苗期，第1组2个小区不施肥作对照;第2组2个小区各施用1×107 CFU/克的地衣芽孢杆菌生物有机肥100公斤作为基肥，在油菜完全发芽3周后各追施一次1×107 CFU/毫升的地衣芽孢杆菌发酵液的稀释液;第3组2个小区按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次;第4组2个按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次，并按照第2组方式施用地衣芽胞杆菌生物有机肥，各小区相同的灌溉和管理方式。油菜生长5周后调查产量和品质。单独施用微生物肥料和单独施用尿素的油菜产量基本一致，都比不施肥的对照小区增产50%左右;两种肥料都施用的比对照小区增产80%左右;油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量以不施肥和单独施用微生物菌剂的最低，还不到国家标准限量值的1/3，施用尿素后又施用微生物菌剂的也低于国家标准限量的1/2，而单独施用尿素的油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量都超标严重。表明该微生物菌剂既有良好的增产效果，又可以明显提高油菜的品质。