申请日2013.02.03
公开(公告)日2014.10.15
IPC分类号C12Q1/04; C12Q1/68
摘要
一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域。本发明以实际生活污水富集的聚磷菌作为标准品来源，菌群进化分支丰富。采用针对聚磷菌的关键功能基因——聚合磷酸盐激酶基因的特异性引物，获得了Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5个主要进化分支的标准品，并采用通用性好、成本较低的SYBR Green荧光染料法建立了5个主要进化分支的实时荧光定量PCR标准曲线。5条标准曲线的相关系数分别为1.000，0.998，0.999，0.999，0.998。扩增效率在90%到110%之间。利用建立的标准曲线对某污水处理系统中聚磷菌的不同进化分支进行定量检测。本发明经济、简便、可靠。
权利要求书
1.一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：提取实际生活 污水富集的聚磷菌的基因组DNA，采用聚磷菌5个分支的聚合磷酸盐激酶基因引物，先采 用温度梯度PCR后进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定不同进化分支的复性温度;再采用常规 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验后，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得I、ⅡA、ⅡB、 ⅡC和ⅡD5个分支的扩增片段;将5个分支的扩增片段与载体连接，连接好的载体导入 感受态细胞培养12-16h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证;提取包含目的片段的质粒用 作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线;利 用建立的标准曲线对污水处理厂中聚磷菌进行定量检测;
上述温度梯度PCR和常规PCR扩增体系及反应条件如下：
以聚合磷酸盐激酶基因为标记物，选择聚磷菌5个进化分支的PCR引物;引物名称、 引物序列，以及扩增子长度如下：
标准品的来源
常规PCR扩增程序如下：95℃变性10min;25-35个循环反应，每个循环包括95℃40s， A℃1min，72℃2min;最后72℃延伸5min;其中复性温度A由梯度PCR确定，不同分 支的复性温度如下：
上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为2%，电泳电压为120V，电泳时间为 60min;
上述实时荧光定量PCR扩增反应体系及反应条件为：
聚磷菌分支Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC的实时荧光定量PCR反应采用三步法，在复性和延 伸阶段检测和报告荧光，扩增程序如下：95℃变性3min;30-55个循环反应，每个循环包 括94℃30s，A℃45s;最后72℃延伸30s;复性温度A℃与常规PCR复性温度相同;分 支IID的实时荧光定量PCR反应采用四步法，扩增程序如下：95℃变性3min;30-55个循 环反应，每个循环包括94℃30s，63℃45s，72℃30s，84℃5s;其中荧光信号检测温度为 84℃。
说明书
污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水 生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中聚磷菌的定量检测。
背景技术
磷是导致地表水体富营养化的关键营养元素，世界各国都对排入地表水 体的磷浓度制定了严格的排放标准。生物除磷技术由于经济高效的特点已被 广泛应用于各大城市污水处理厂。虽然生物除磷技术应用于污水处理已有几 十年的历史，积累了大量的运行经验，但在污水处理厂运行过程中仍然时常 出现不明原因的除磷效果恶化的现象，甚至不得不借助于化学除磷。产生这 些问题的根本原因是由于对生物除磷过程主要功能微生物——聚磷菌的代 谢活性和种群结构缺少清楚的认识和理解，从而无法建立有效的调控措施。 污水生物处理系统内除磷微生物学研究是污水生物除磷最基本、最重要的内 容，是生物除磷系统高效稳定运行的保障。
大量研究已经证明，无论是实验室规模还是生产规模的生物除磷系统 中，聚磷菌都是占主导地位的除磷微生物。但是由于聚磷菌种群的复杂性和 多样性，不同污水处理系统中的聚磷菌对环境的动态响应结果差异很大，因 此只有对这一复杂菌群的菌群结构进行细化分类与精确定量，才能清楚的认 识其细菌种类和密度随环境的变化情况、才能认识菌群的稳定性特征、才能 明确聚磷菌在磷元素降解过程中的作用，对提高污水处理系统除磷效果具有 重要意义。由于无法实现纯培养，因此不依赖于纯培养的分子生物学分析方 法成为聚磷菌研究的主要手段。目前，研究者主要借助于荧光原位杂交 (FISH)、限制性末端片段长度多态性分析(T-RFLP)、PCR-基因测序等方 法识别并定量分析活性污泥样品中的聚磷菌。上述方法多数采用16S rRNA 作为基因标记物，但由于16S rRNA的高度保守性使其无法区分聚磷菌的各 进化分支，因此上述方法都无法实现对聚磷菌不同进化分支的区分与定量。 与相对保守的16S rRNA相比，功能基因具有更多的序列变化，利用功能基 因可以区分生态功能不同但亲缘相近的微生物种群。聚合磷酸盐激酶是聚磷 菌细胞内催化合成聚合磷酸盐的关键酶，直接影响聚磷菌的除磷效果。由于 聚合磷酸盐激酶基因的高系统分辨率和清晰的树结构，因此在揭示聚磷菌种 群结构上，较16S RNA是更好的遗传标记。因此本专利采用编码聚合磷酸盐 激酶的功能基因作为遗传标记解析污水处理系统中聚磷菌的代谢活性和菌 群结构，从微观角度揭示聚磷菌各进化枝对环境条件的动态响应，为污水生 物除磷系统的稳定运行奠定微生物学理论基础。
实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特 异性、高精确度、实时性、污染少等优点，在微生物生态学中逐渐得到广泛 的应用。以聚合磷酸盐激酶基因作为标记物的实时荧光定量PCR，使我们不 仅可以定性，也可以定量研究污水处理系统中聚磷菌的不同进化分支的结构 组成及数量变化，从而深入探索聚磷菌群落与环境因子之间的相互作用及其 动态变化过程。
本发明采用实时荧光定量PCR技术对污水处理厂中的聚磷菌进行定量 检测。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面：
(1)标准品DNA的来源。目前聚磷菌无法实现纯培养，因此标准品只 能来自聚磷菌的富集培养系统，从富集聚磷菌的活性污泥中提取DNA作为 标准品来源。但是目前对聚磷菌的富集，主要集中在人工配水系统，由于人 工配水的碳源主要选择乙酸或丙酸，使聚磷菌的种群单一，以ⅡA分支为主， 其次为I分支，并导致后基因组学研究也主要集中在ⅡA和I分支。这样就 无法实现获得聚磷菌所有分支或主要分支的标准品。本专利采用的标准品全 部来源于处理实际生活污水的反应器，运行过程中，工艺条件和废水成分都 接近实际生产情况，并且反应器取得了良好的除磷效果，出水磷浓度优于《城 镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)规定的一级A排放标准。 由于富集系统运行条件和废水成分的复杂性，使得聚磷菌菌群分支丰富，获 得了主要的5个进化分支的标准品，分别为I、ⅡA-D。
(2)基因标记物的选择。不同研究者的试验系统存在不同的聚磷菌分 支，根本原因在于基因型的不同。因此，只有找到一种能够区分聚磷菌各进 化分支的基因标记物，才能阐明聚磷菌菌群的生态生理学特性和分析产生争 议的原因。16S rRNA是广泛采用的基因标记物，但由于16S rRNA的高度保 守性使其无法区分聚磷菌的各进化分支。聚合磷酸盐激酶是聚磷菌细胞内催 化合成聚合磷酸盐的关键酶，好氧吸磷速率与聚合磷酸盐激酶活性呈线性关 系。而聚合磷酸盐激酶基因是编码合成这种酶的功能基因，该基因的表达过 程直接影响聚磷菌的代谢活性和吸磷效果。聚磷菌细胞内的聚合磷酸盐激酶 基因是单拷贝基因，其进化速度是16S rRNA的5倍，是研究聚磷菌各进化 分支的很好的基因标记物。因此，本申请选择聚合磷酸盐激酶功能基因作为 遗传标记，不仅可以进一步明确聚磷菌的各进化枝，而且可以建立聚合磷酸 盐激酶基因表达对生物除磷系统环境条件变化的动态响应机制。
(3)实验方法的选择及实验条件的优化。①目前根据荧光定量途径的不 同，实时荧光定量PCR测定主要包括两种方法：SYBR Green荧光定量法和 Taqman探针法。Taqman探针法在常规PCR扩增过程中，用探针对产物进行 检测，可获得较高的检出精度。但Taqman荧光探针合成费用较高，大规模 应用时经济效益低。而SYBR Green荧光定量法实验方法简单(仅需2个引 物，不需要设计探针)，无需设计多个探针即可检测多个基因，通用性好、 成本低。因此SYBR Green荧光定量法更适合种群复杂、分支众多的聚磷菌 菌群。由于SYBR Green与所有的双链DNA都可以结合，因此引物二聚体、 单链二级结构以及错误扩增产物的出现会增加荧光值，从而影响定量的精确 性。因此本申请首先通过熔融曲线分析目标产物的均一性，如果存在非特异 性扩增产物，就采取四步法消除非特异性扩增对于某些分支的影响。四步法 即在通用的三步法的延伸步骤之后，增加一个短暂的恒温和荧光检测步骤 (84℃，5s)，使这个步骤的温度高于引物二聚体的溶解温度(Tm)，但低于 目标产物的Tm。在本申请中，非特异性扩增对Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC分支没 有影响，因此采用通用的三步法。但非特异性扩增对IID分支影响显著，采用 四步法。定量结果表明，四步法有效消除了非特异性扩增产物对目标产物定 量带来的影响。②用Real-Time PCR进行环境样品的特定菌群密度定量过程 中，样品预处理方法和参数的选择对于测定结果有较大的影响。将实时荧光 定量PCR应用于污水处理厂主要功能微生物聚磷菌的检测，待测样品为污水 处理系统中的活性污泥，样品本身具有极强的特殊性。由于聚磷菌以污水为 生存基质，污水中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂质等，对 DNA的提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此本申请对分 析难度较大的聚磷菌不同进化分支的实验条件进行了探索和优化，并获得了 较好的扩增效果和定量结果。
故本发明从实际生活污水富集培养的聚磷菌中提取基因组DNA，以聚合磷 酸盐激酶功能基因作为遗传标记，针对聚磷菌不同的分支采用不同的特异性引 物，建立检测聚磷菌5个主要分支的实时荧光定量PCR标准曲线。利用建立的 标准曲线对污水全程脱氮除磷和短程脱氮除磷系统中的聚磷菌进行定量检测，通 过运行条件的改变建立聚磷菌的种群结构和聚合磷酸盐激酶基因表达对实 际污水脱氮除磷系统环境条件变化的动态响应机制，未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济、可靠的污水处理厂聚磷菌实时荧光定量 PCR检测方法，以聚合磷酸盐激酶基因作为标记物，成功区分聚磷菌不同进化 分支，利用SYBR Green荧光染料法，无需设计多个探针即可检测多个基因， 通用性好、成本低，并且可同时进行大批量的样本分析。可用于污水处理厂聚 磷菌菌群数量的监控和鉴定，具有很好的应用前景。
本发明的技术方案：
一种污水处理厂聚磷菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：提取实 际生活污水富集的聚磷菌的基因组DNA，采用聚磷菌5个分支的聚合磷酸盐激 酶基因引物，先采用温度梯度PCR后进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定不同进化 分支的复性温度;再采用常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检验后，切胶纯化回 收DNA扩增片段，获得I、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5个分支的扩增片段;将5 个分支的扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培养12-16h，挑 取白斑进行重组菌落PCR验证;提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定量 PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线;利用建立 的标准曲线对污水处理厂中聚磷菌进行定量检测;
上述温度梯度PCR和常规PCR扩增体系及反应条件如下：
常规PCR扩增程序如下：95℃变性10min;25-35个循环反应，每个循环包 括95℃ 40s，A℃ 1min，72℃ 2min;最后72℃延伸5min;其中复性温度A由 梯度PCR确定，不同分支的最佳复性温度如下：
温度梯度PCR仅一次实验就能确定特定体系相应的最佳复性温度。从而可 在短时间内对PCR实验进行优化，对于分支众多的聚磷菌菌群，大大提高了PCR 效率。
上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为2%，电泳电压为120V，电 泳时间为60min;
上述实时荧光定量PCR扩增反应体系及反应条件为：
聚磷菌分支Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC的实时荧光定量PCR反应采用三步法，在 复性和延伸阶段检测和报告荧光，扩增程序如下：95℃变性3min;30-55个循环 反应，每个循环包括94℃ 30s，A℃ 45s;最后72℃延伸30s;复性温度A℃与 常规PCR复性温度相同;分支IID的扩增程序如下：95℃变性3min;30-55个 循环反应，每个循环包括94℃ 30s，63℃ 45s，72℃ 30s，84℃ 5s;其中荧光 信号检测温度为84℃。
本发明的有益效果：
生物除磷技术是经济高效的降低污水出水磷浓度，从而有效缓解水体富营养 化的污水处理工艺。对污水处理系统中参与磷代谢的主要微生物聚磷菌进行定 性与定量分析，是维持除磷系统稳定运行的关键。聚磷菌具有菌群结构复杂性 和多样性的特点，使得必须对其不同进化分支进行单独定量分析，并考察不同进 化分支对环境的响应情况，才能清楚的了解其在工艺运行中起的作用，才能使人 为调控成为可能。本发明以聚磷菌的关键功能基因——聚合磷酸盐激酶基因作 为标记物，提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂中聚磷菌5个主要进化 分支的实时荧光定量PCR检测方法，既可用于城市污水处理厂日常运行的微生 物监控，保证生物除磷效果;又可用于实验室有关聚磷菌的定量分析、代谢机制、 基因表达解析的研究，具有较强的实用性。
本发明通过提取实际污水处理系统中富集的聚磷菌的基因组DNA，采用针 对聚磷菌功能基因——聚合磷酸盐激酶基因的特异性PCR引物，经常规PCR扩 增和琼脂糖凝胶电泳检验后，切胶纯化回收DNA扩增片段，获得5个主要进化 分支的PCR产物。将纯化产物经质粒转化和克隆培养后，提取包含目的片段的 质粒DNA作为实时荧光定量PCR检测聚磷菌的标准品。在实时荧光定量PCR 仪上进行检测，建立标准曲线。5条实时荧光定量PCR标准曲线均呈现良好的 线性关系，相关系数、斜率与扩增效率如表1所示。上述指标表明，该方法符合 精确定量的要求。同时，熔融曲线分析保证了扩增产物的特异性。可以利用建立 的标准曲线对未知样品中聚磷菌各个分支的菌群数量进行定量检测。本发明成 功的建立了聚磷菌5个主要进化分支的实时荧光定量PCR标准曲线，使单独研 究不同分支对环境的动态响应成为可能。而且利用SYBR Green荧光染料法，检 测成本降低，便于推广应用。
表15个分支聚磷菌实时荧光定量PCR标准曲线的相关系数、斜率与扩增效率
本发明的创新点：
(1)本发明提取实际生活污水处理系统中富集的聚磷菌的基因组DNA作 为标准品DNA的来源，获得了5个主要进化分支的标准品。与人工配水系统相 比，菌群分支更丰富，对监测污水处理厂聚磷菌菌群动态变化具有更强的适用 性。
(2)本发明采用与聚磷菌相关的关键功能基因——聚合磷酸盐激酶基因作 为标记物，成功实现对5个进化分支的区分定量。获得的实时荧光定量PCR标 准曲线，线性良好，扩增效率高，符合精确定量的要求。熔融曲线分析保证了扩 增产物的特异性。利用SYBR Green荧光染料法，通用性好，检测成本低。四步 法巧妙的解决了引物二聚体等非特异性扩增对聚磷菌IID分支定量带来的影响。
(3)本发明为污水处理厂中主要功能微生物“聚磷菌”不同进化分支的定 量检测提供了一种经济、简便、可靠的分析方法，可用于所有除磷系统中聚磷菌 的定量检测，为污水处理厂的长期稳定运行提供有力保障。