申请日2014.02.27
公开(公告)日2016.06.01
IPC分类号G01N21/64; G01N1/28
摘要
本发明公开了一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：将处理废水后的黄孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液体培养基中继续培养，再向培养后的液体培养基中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠得混合液，将混合液孵育、过滤，过滤后得到的菌球经超声破碎、离心后，提取上悬液，最后测定上悬液中氧化型二氯荧光素的荧光强度。该发明具有操作条件简单、易于实施、能够准确直观的测定处理废水后的黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的优点。
权利要求书
1.一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，其特征在于包括以下步骤：将处理废水后的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌球清洗后，加入液体培养基中继续培养，再向培养后的液体培养基中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠得混合液，将混合液孵育、过滤，过滤后得到的菌球经超声破碎、离心后，提取上悬液，最后测定上悬液中氧化型二氯荧光素的荧光强度;所述液体培养基中菌体的湿重为4g～8g，所述混合液中2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠的摩尔浓度为2μM～10μM;所述超声破碎的温度为0℃～4℃，功率为400w～600w，总超声破碎时间为4min～6min，单次超声持续3s～4s，单次超声间隔8s～9s。
2.根据权利要求1所述的测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，其特征在于：所述液体培养基为Kirk液体培养基。
3.根据权利要求1所述的测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法，其特征在于：所述孵育的条件为室温、避光孵育，孵育时间为0.5h～1.5h。
说明书
测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法
技术领域
本发明涉及微生物应用领域和废水处理领域，尤其涉及一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法。
背景技术
当下，重金属和有机污染物对环境的危害已经成为一个全球性的问题。在目前废水处理领域，现有技术已经能够利用黄孢原毛平革菌去除废水中的重金属和有机物，然而废水中的污染物对菌体产生的氧化应激作用以及菌体本身对废水的一个耐受性也值得我们关注。
现有活性氧水平的检测方法主要集中用于动植物等高等生物体内活性氧的检测，其使用的检测方法基本为流式细胞术，但流式细胞仪价格高昂，检测费用高，仪器操作复杂，且不宜批量检测。在现有的2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)荧光探针技术中，会存在探针载入细胞失败，以及细胞外残余的未进入细胞内的探针没有被洗净，导致背景值较高等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种准确直观、操作简单、易于实施的测定处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内活性氧水平的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种测定处理废水后黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)菌体内活性氧水平的方法，包括以下步骤：将处理废水后的黄孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液体培养基中继续培养，再向培养后的液体培养基中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠得混合液，将混合液孵育、过滤，过滤后得到的菌球经超声破碎、离心后，提取上悬液，最后测定上悬液中氧化型二氯荧光素的荧光强度。
作为本发明的进一步改进，
所述液体培养基中菌体的湿重为4g～8g，所述混合液中2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠的摩尔浓度为2μM～10μM。
所述液体培养基为Kirk液体培养基。
所述孵育的条件为室温、避光孵育，孵育时间为0.5h～1.5h。
所述超声破碎的温度为0℃～4℃，功率为400w～600w，总超声破碎时间为4min～6min，单次超声持续3s～4s，单次超声间隔8s～9s。
本发明中黄孢原毛平革菌菌悬液的制备步骤包括：将黄孢原毛平革菌孢子粉末悬浮于无菌水中制成孢子悬液，并调节浊度值为60%，即每毫升孢子悬液中含2.5×106个孢子，再将孢子悬液接种到Kirk液体培养基中于35℃～39℃，140r/min～160r/min条件下，振荡培养60h～72h，得黄孢原毛平革菌菌悬液。
本发明中黄孢原毛平革菌菌球处理废水的步骤包括：将黄孢原毛平革菌菌悬液中的菌球加入至pH6.0～7.0的镉废水或二氯酚废水中，于35℃～39℃，140r/min～160r/min条件下处理12h，过滤废水，回收菌球，黄孢原毛平革菌菌悬液中菌球的干重质量与废水的体积比为0.3∶1g/L～0.5∶1g/L。
活性氧(ROS)是具有高度反应性的小分子，包括超氧阴离子(O2-)、羟基自由基(OH)和过氧化氢(H2O2)等;其存在于人类和生物体内并源于氧。ROS能够通过与DNA、蛋白质和脂质分子反应而改变细胞的功能，其通常作为不同代谢途径的副产物存在于生物系统中。它们还在细胞信号转导和免疫系统细胞活性的调节中具有关键作用，过量的ROS会对菌体细胞结构和功能造成很大损害。
氧化应激(OxidativeStress，OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。氧化应激本身是难以被抓住并在体内进行测定的现象，因此，只能通过间接方法来测定它们的水平。
2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)是活性氧的特异探针，它本身不发荧光，可自由穿过细胞膜进入到细胞内，被胞内的酯酶分解为无荧光的还原型二氯荧光素(DCFH)而保留在胞内，各类ROS会氧化DCFH为发强绿色荧光的氧化型二氯荧光素(DCF)，DCFH被氧化成DCF的量(或荧光强度)与自由基的含量成正比，即细胞内DCF的量(或荧光强度)能直接反应细胞内自由基的含量，因此利用荧光分光光度计检测胞内的DCF荧光强度即可反映细胞的ROS水平。
与现有技术相比，本发明的优点为：
1.本发明将活性氧水平的检测方法从动植物领域扩展到了白腐真菌领域，能够直观、准确的对废水处理后受污染物胁迫的黄孢原毛平革菌菌体内产生的ROS水平进行表征，操作条件简单且容易实施。
2.本发明将处理废水回收后的菌球经去离子水清洗后加入培养液中继续培养，再向混合液中加入2′,7′-二氯二氢荧光黄双乙酸钠。通过继续培养可以使DCFH-DA顺利地通过细胞膜进入细胞内，同时过滤洗净后的细胞外几乎没有残余的探针，不会产生误差。并且使用超声破碎，大大提高了白腐真菌的破碎效率，能够快速可靠地检测其胞内活性氧的水平。
3.本发明所使用的黄孢原毛平革菌菌球是由孢子粉末加入液体培养基中制备而成，制备工艺简单，易于扩大培养，实用性强。
4.本发明除了可以测定处理废水后的黄孢原毛平革菌菌体内的活性氧水平，同样可以测定未处理废水的黄孢原毛平革菌菌体内的活性氧水平，甚至包括其他白腐真菌。并且通过本发明检测处理废水后黄孢原毛平革菌菌体内DCF的荧光强度，可以得出黄孢原毛平革菌处理废水的最佳浓度，能为重金属和有机污染物对黄孢原毛平革菌产生的氧化应激的毒性机制的研究提供基础。本发明对于进一步研究黄孢原毛平革菌在处理重金属和难降解有机污染物等异生物质时，菌体内特殊抗氧化系统的变化具有重要意义，本发明也对白腐真菌在环境生物治理上的应用具有促进作用。
本发明采用的菌种为黄孢原毛平革菌(BKM-F1767)购自位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCATTC24725，优选采用该菌株，但不限于此。