申请日2014.09.17
公开(公告)日2014.12.17
IPC分类号C12N1/20; C12R1/40; C02F3/34
摘要
本发明属于水处理技术领域，具体涉及一种从污水处理厂氧化沟外沟中的活性污泥中筛选反硝化聚磷菌株及利用其去除废水中的硝酸盐氮和总磷方法。该菌株命名为B8，现保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.9168。经鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida sp.。利用上述菌种制得的菌液按照接菌量以质量分数计为10%的比例投菌到废水中，经厌氧-好氧流程或厌氧-缺氧流程能高效去除污水中硝酸盐氮和总磷。
权利要求书
1.反硝化聚磷菌菌种保藏编号为CGMCC NO.9168，命名为B8，经鉴定为恶臭假 单胞菌Pseudomonas putida sp.。
2.利用权利要求1所述的菌种去除废水中硝酸盐氮和总磷的方法，其特征按照 下述步骤进行：B8菌株接种于pH6.5的50mL自制的DNJPU培养液中，放置于 振荡培养箱(温度30℃，转速120r/min)中进行培养20h，得到B8菌液。将此 菌液按照接种量以质量分数计为10%的比例投菌到废水中，在26-30℃下分别经 厌氧-好氧流程或厌氧-缺氧流程处理9-25小时即能高效的去除废水中硝酸盐氮 和总磷。
3.根据权利要求2所述的反硝化聚磷菌株B8及利用其去除废水中硝酸盐氮和总 磷的方法，其特征在于其中所述的DNJPU培养液组成如下：(NH4)2SO42.75g; Na2HPO430.6g;KH2PO43g;MgSO4·7H2O0.25g;CaCl20.25g;柠檬酸钠4.0g; NaCl2.5g;蔗糖0.01g;蒸馏水1000mL。
说明书
反硝化聚磷菌株及利用其去除废水中硝酸盐氮和总磷的方法
技术领域
本发明属于水处理技术领域，具体涉及一种从污水处理厂氧化沟外沟中的活性污泥中筛 选反硝化聚磷菌株及利用其去除废水中的硝酸盐氮(NO3--N)和总磷(TP)方法。
背景技术
地表水环境污染问题之一是水体富营养化，藻类大量繁殖引发淡水区域“水华”和海域的 “赤潮”现象。生态学中的“利比希(Liebig)最小因子定律”表明，水体中较高浓度的氮、磷 含量是引发地表水体富营养化的主要环境因素，当总磷浓度超过0.1mg/L(如果磷是限制因素) 或总氮浓度超过0.3mg/L(如果氮是限制因素)时，藻类会过量生长，引发江河、湖塘、近海的 富营养化。
我国地表水体绝大部分氮、磷污染物来源于城镇生活污水和工业废水的排放。据统计， 近5年来我国每年有近600亿吨的携带有氮、磷污染物的废水排放至自然水体中。虽然我国 《城镇污水处理厂排放标准(GB 18918-2002)》与各行业排放标准均对总氮(TN)排放浓度 均有规定，但环保部门对污水处理厂出水指标仍以化学需氧量(COD)、总磷(TP)、氨氮 (NH4+-N)作为总量控制指标，从而造成出水NH4+-N达标、而TN超标成为较普遍现象。 从技术上来说，主要是由于NH4+-N变成氮气(N2)的过程是先通过好氧硝化途径将NH4+-N 最终转化为NO3--N，然后再通过缺氧反硝化途径使NO3--N变成N2去除。所以废水中的NH4+-N 指标虽然低了，但氮元素仍然以NO3--N的形式存在于水中，污水中的TN含量依然较高，其 中大部分为NO3--N，致使污水处理厂出水TN达不到排放标准。而藻类生长正好是先需摄取 NO3-，并非是NH4+-N，水体中高浓度的NO3--N更易促使藻类疯长。因此，近来对废水中NO3--N 的去除日益受到重视。在我国的太湖流域、滇池流域等区域对排放废水的总氮开始严格执行 相关排放标准(包括国家或地方排放标准)，如江苏省地方排放标准《太湖地区城镇污水处理 厂及重点工业行业主要水污染物排放限值》(DB32/1072-2007)，并关注外排出水中的NO3--N 浓度。
废水处理厂多采用生物法即生物强化脱氮除磷工艺(如A2/O、SBR、氧化沟等)，而反 硝化聚磷菌是生物强化脱氮除磷工艺的主要功能菌群。反硝化聚磷菌(denitrifying poly-phosphate accumulating organisms，DNPAOs)是一类以氧或硝酸盐氮为电子受体聚磷的 菌群，在厌氧环境中DNPAOs释放体内的多聚磷酸盐(Poly-P)获得能量吸收水体中的挥发 性脂肪酸，将其储存为聚羟基脂肪酸酯(PHA);在好氧或缺氧环境中再消耗PHA，以氧或 硝酸盐氮为电子受体超量吸收水中的磷，并在菌株体内再次合成Poly-P。利用聚磷菌进行生 物除磷，既节省了投加化学药剂除磷所增加的成本，又避免了化学除磷产生的化学污泥。
城市污水处理厂的活性污泥中一般均存有反硝化聚磷菌，因此可利用适当的培养基对反 硝化聚磷菌进行培养、筛选与分离。近年来国内外对反硝化聚磷微生物研究较为活跃，《中国 环境科学》2011年第31卷第6期958-964页报道了刘晖等利用活性污泥与生物膜复合系统富 集反硝化聚磷菌并获得具有脱氮聚磷能力的菌种YB(Paracoccus denitrificans)，其聚磷率与 脱氮率均达到90%以上;《安徽农业科学》2011年第39卷第18期11040-11046页报道了刘艳 萍等采用牛肉膏蛋白胨培养基进行平板分离技术，从城市河道底泥中筛得3株反硝化聚磷菌 DPB-A511(Dechloromonas aromatic)、DPB-A9(Candidatus accumulibacter phosphatis)和 DPB-A10(Bacillus pumilus)，其聚磷率与脱氮率均达到50%。中国发明专利(申请公告号 CN 102864098A)公开了一株反硝化聚磷细菌H-hrb02及其筛选方法和应用效能，该反硝化 聚磷菌是一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其为非发酵革兰氏阴性菌且专性需 氧，能以多种有机物为碳源，除磷率可高达92.0%，TN去除率高达87.7%。中国发明专利(申 请公告号CN 101386822A)公开了一株特效聚磷菌HJP07(Pseudomonas sp.)在30℃、150r/min 摇床上培养至对数生长期后将其投加入强化淹没生物膜-活性污泥的好氧段中且使系统反应 池中的聚磷菌浓度大于104CFU/L，14d后系统稳定运行其除磷率稳定于86.2%以上。中国发 明专利(申请公告号CN 103103153A)公开了一株从双泥序批式反应器缺氧结束时的污泥中 分离筛选得到的反硝化聚磷菌CL-5(Paenibacillus lautus)，其整个生长周期氮磷去除率分别 为72.3%和64.1%。
本发明以安徽省天长市污水处理厂氧化沟外沟中的活性污泥中的微生物作为反硝化聚磷 菌的来源，从中筛选出高效反硝化聚磷菌的菌株。主要创新基于以下三点：
其一，获取含有反硝化聚磷菌的混合菌群并从中筛选出高效的反硝化聚磷菌。
以BOT方式运营的安徽省天长市城市污水处理厂采用氧化沟工艺经过长期反复培养驯化 活性污泥，近3年来其出水TP、TN全年低于国家一级A标准(即TP<0.5mg/L、TN<15mg/L)， 表明该厂活性污泥中驯化了以城市污水为碳源的、具备有脱氮除磷性能的微生物。因此，以 该厂活性污泥中的微生物作为反硝化聚磷菌的来源构成了本发明的一大特色。
其二，选用自制培养基(DNJPU)对反硝化聚磷菌进行专性筛选。
自制DNJPU培养基的具体成分为在1L的蒸馏水中含有：(NH4)2SO42.75g;Na2HPO430.6 g;KH2PO43g;MgSO4·7H2O0.25g;CaCl20.25g;柠檬酸钠4.0g;NaCl2.5g;蔗糖0.01g; 琼脂粉(制平板或斜面时添加)20g。从DNJPU培养基的成分可以看出其中氮、磷浓度较高， 在初筛时候使用时可以有目的的从菌源样品中筛选出摄取高浓度氮磷生长的菌种，避免了非 反硝化聚磷菌株的初筛、复筛和验证的重复性操作，从而节省成本和时间。
其三，采用实际污水处理厂调节池中的废水作为菌种脱氮除磷效果验证的处理对象。
在以往的反硝化聚磷菌脱氮除磷效果验证的处理对象大多数为含氮、磷的无机盐培养基 或配制的模拟废水，很少采用实际污水作为菌种脱氮除磷效果验证的处理对象。本发明采用 江苏常州马杭污水处理厂调节池中的废水作为菌种脱氮除磷效果验证的处理对象，克服了因 培育出的反硝化聚磷菌适应不了实际废水水质的难题，使得规模化生产反硝化聚磷菌菌剂及 应用于各个污水处理厂成为可能。
发明内容
本发明的目的提供一种从安徽省天长市污水处理厂活性污泥中筛选出的反硝化聚磷菌， 并提供利用筛选出的菌株去除中硝酸盐氮和总磷的方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种从安徽省天长市污水处理厂氧化沟外沟中的活性污泥中筛选得到的反硝化聚磷菌 B8，已于2014年5月16日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生 物研究所菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.9168。经鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida sp.)，与已公开报道具有反硝化除磷功能的DPB-A511、DPB-A9、DPB-A10、YB、CL-5 菌株为不同种，而与已公开报道具有反硝化除磷功能的H-hrb02菌株为不同属。
利用上述菌种进行多聚磷酸盐颗粒(Poly-P)培育的方法，按照下述步骤进行：
用接种笔挑取1环B8菌株接种于pH5.5～8.0的50mL的自制培养液(DNJPU)中，放 置于振荡培养箱(温度20～40℃，转速80～180r/min)中进行培养5～35h，得到B8菌液。 再向菌液中投加2%的多聚磷酸盐(Poly-P)染色液置于30℃下静置染色24h，按同样的操作 制作空白。对种子液和空白经8000r/min离心15min，对上清液分别在625nm处测定其吸光 度，将测量结果代入多聚磷酸盐染色液(DNJPU-TBO)染色率公式得到DNJPU-TBO染色率， 以DNJPU-TBO染色率来表征Poly-P在种子液中的含量。DNJPU-TBO染色率计算公式为：
DNJPU-TBO染色率={(A0-A)/A0}×100%
其中：A0为未接菌菌液在DNJPU-TBO于625nm处的吸光度;A为接菌后菌液在 DNJPU-TBO于625nm处的吸光度。
上述多聚磷酸盐颗粒(Poly-P)培育的方法优选：用接种笔挑取1环B8菌株接种于pH6.5 的50mL的DNJPU培养液中，放置于振荡培养箱(温度30℃，转速120r/min)中进行培养 20h，得到B8菌液。再向菌液中投加2%的多聚磷酸盐(Poly-P)染色液置于30℃下静置染 色24h，按同样的操作制作空白样。对种子液和空白样经8000r/min离心15min，对上清液分 别在625nm处测定其吸光度，以DNJPU-TBO染色率来表征多聚磷酸盐颗粒在种子液中的含 量，从而得到高Poly-P含量的反硝化聚磷菌B8菌液。
其中所述自制培养液(DNJPU)组成是在1L的蒸馏水中含有：(NH4)2SO42.75g; Na2HPO430.6g;KH2PO43g;MgSO4·7H2O0.25g;CaCl20.25g;柠檬酸钠4.0g;NaCl2.5g; 蔗糖0.01g。此溶液使用前需要进行灭菌。
其中所述多聚磷酸盐(Poly-P)染色液组成为，在1L的蒸馏水中含有：(NH4)2SO42.75 g，Na2HPO430.6g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O0.25g，CaCl20.25g，柠檬酸钠4.0g，NaCl2.5 g，蔗糖0.01g，甲苯胺蓝0.025g。此溶液使用前需要进行灭菌。
上述灭菌，采用高压灭菌，高压灭菌的条件可为121℃，20min。
利用上述反硝化聚磷菌B8菌液去除氮、磷的方法，按照下述步骤进行：
用无菌水4000r/min离心15min清洗3次高Poly-P含量的反硝化聚磷菌B8菌液，再将其 按10%接菌量投加至取自于江苏省常州市马杭污水处理厂调节池中的废水后，进行厌氧—好 氧流程处理或者厌氧—缺氧流程处理。其中：
(1)厌氧—好氧流程具体操作方式为：将加了菌的水样置于密闭容器中，再向150mL 的容器中投入磁力转子再充入氮气5min后立即拧紧瓶塞，充分振荡后置于控温磁力搅拌器 (30r/min)中转子搅拌处理，此作为厌氧处理。再将水样置于盖有8层纱布的敞口容器中搖 床振荡充氧培养，此为好氧处理。处理后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上 清液，测定水样中的TP、NO3--N浓度，并计算其去除率。
(2)厌氧—缺氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中，再向150mL的容 器中投入磁力转子再充入氮气5min后立即拧紧瓶塞，充分振荡后置于控温磁力搅拌器 (30r/min)中转子搅拌处理，此作为厌氧处理。缺氧处理为将水样置于盖有8层纱布的敞口 容器中进行间歇低速搅拌培养，即将容器置于搖床每隔55min以60r/min的转速振荡5min。 处理后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP、NO3--N浓 度，并计算其去除率。
本发明的主要优点：
1、本发明选用价廉易得的反硝化聚磷菌专性培养基DNJPU筛选、分离、纯化反硝化聚 磷菌和多聚磷酸盐颗粒染色优化培育，具有成本低、快速、安全、高效等特点。
2、本发明选择在安徽省天长市污水处理厂的氧化沟中采集富含反硝化聚磷菌微生物的活 性污泥样品，所筛选出的菌株源于污水处理厂水体，适应于污水处理厂的环境，对于生物法 去除污水处理厂废水中的TP、NO3--N具有较广阔的应用前景。
具体实施方式
(1)样品采集
采样对象是以BOT方式运营的安徽省天长市城市污水处理厂氧化沟外沟中的活性污泥， 装入采样瓶中取回，放入4℃下保存备用。
采集江苏省常州市马杭污水处理厂调节池中的废水于采样瓶中，用于TP、NO3--N去除试 验。
(2)培养基配置
DNJPU培养基：将(NH4)2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、柠檬酸钠、 NaCl、蔗糖、琼脂粉加入蒸馏水中定容至1L于锥形瓶中，先在电炉上加热，并用玻璃棒快 速搅拌使之快速溶解，再用8层纱布和牛皮纸将锥形瓶密封好，使用高压蒸汽灭菌锅121℃， 20min灭菌后即得DNJPU培养基。
(3)筛选方法
取100mL的安徽省天长市污水处理厂氧化沟外沟的活性污泥于250mL的锥形瓶中，置 于30℃下摇晃培养(130r/min)6h。使用稀释倍数法将原污泥稀释，涂布于DNJPU平板30℃ 培养48h，观察菌落生长情况，依据各个菌落的形态和表色不同，挑取单一菌落于DNJPU平 板上30℃培养48h。此后，使用DNJPU平板进行“S”形划线提纯，共提纯3次，复筛4次， 最后将提纯复筛得到的菌种B8划线于DNJPU斜面30℃培养48h后，置于冰箱4℃左右保存。
(4)菌株形态及生理生化性能
通过对菌株进行形态观察、染色反应和生理生化测试，并根据科学出版社出版的《伯杰 氏细菌鉴定手册》(第八版)对其进行鉴定。结果如下：
菌落形态特征为：在DNJPU固体培养基上菌落呈圆形、凸起、边缘呈现锯齿状、牛奶色 的光滑型菌落。
菌落生理生化特征为：革兰氏染色、乙酰甲基醇(V.P)、甲基红(M.R)、淀粉水解和葡 萄糖发酵皆为阴性，接触酶、明胶水解、葡萄糖氧化和产硫化氢均为阳性。
上述筛选到的菌株保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.9168。经鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida sp.。
(5)多聚磷酸盐颗粒(Poly-P)培育的方法优选
用接种笔挑取1环B8菌株接种于pH6.5的50mL的DNJPU培养液中，放置于振荡培养 箱(温度30℃，转速120r/min)中进行培养20h，得到供试菌液。再向菌液中投加2%的多聚 磷酸盐(Poly-P)染色液置于30℃下静置染色24h，按同样的操作制作空白样。对种子液和 空白样经8000r/min离心15min，对上清液分别在625nm处测定其吸光度，以DNJPU-TBO 染色率来表征多聚磷酸盐颗粒在种子液中的含量，得到多聚磷酸盐颗粒染色率为61.03%，从 而得到高Poly-P含量的反硝化聚磷菌B8菌液。
(6)菌株脱氮除磷特性测试
利用上述优化培育菌液进行脱氮除磷的具体实施例如下：
实施例所处理废水取自江苏省常州市马杭污水处理厂，该厂主要承接湖塘纺织城印染工 业废水和常州武进区南部城区的城市污水。由于部分印染企业使用了含氮染料，所以其 NO3--N浓度偏高。水质指标为：pH=7.0-8.0，COD浓度267.2-274.4mg/L，TP浓度4.0-4.5mg/L， NO3--N浓度35.0-36.5mg/L。
实施例1
本实施例处理取自江苏省常州市马杭污水处理厂调节池中的废水150mL，主要进行菌液 的厌氧—好氧流程的脱氮除磷试验。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8菌液，再按10%投 菌量投加至待处理废水后，进行厌氧—好氧流程处理。厌氧—好氧流程具体操作为：将加了 菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度为26℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处 理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床中(26℃，120r/min)好氧培养21h后取水样，再将 水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N浓度。初始水样 TP=4.32mg/L经4小时厌氧释磷为5.74mg/L，经21小时好氧处理后TP降为2.47mg/L，得到 B8菌处理后的除磷率为42.82%。而在好氧除磷过程中，NO3--N浓度变动不明显，其去除率 仅为1.08%至2.24%。
实施例2
本实施例处理取自江苏省常州市马杭污水处理厂调节池中的废水150mL，主要进行菌液 的厌氧—好氧流程的脱氮除磷试验。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8菌液，再按10%投 菌量投加至待处理废水后，进行厌氧—好氧流程处理。厌氧—好氧流程具体操作为：将加了 菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度为30℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处 理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床中(30℃，120r/min)好氧培养5h后取水样，再将水 样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N浓度。初始水样TP=4.40mg/L 经4小时厌氧释磷为5.80mg/L，经5小时好氧处理后TP降为0.26mg/L，得到B8菌处理后 的除磷率为94.09%。而在好氧除磷过程中，NO3--N浓度变动不明显，其去除率仅为1.32%至 2.13%。
实施例3
本实施例处理取自江苏省常州市马杭污水处理厂调节池中的废水150mL，主要进行菌液 的厌氧—缺氧流程的脱氮除磷试验。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8菌液，再按10%投 菌量投加至待处理废水后，进行厌氧—缺氧流程处理。厌氧—缺氧流程具体操作为：将加了 菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度为30℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处 理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床中(30℃，60r/min)每隔55min搖晃5min缺氧培养 5h后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N浓 度。初始水样TP=4.38mg/L经4小时厌氧释磷为5.87mg/L，经5小时缺氧处理后TP降为 2.46mg/L，得到B8菌处理后的除磷率为43.84%。而在缺氧除磷过程中，初始水样 NO3--N=35.94mg/L经过4小时厌氧和5小时缺氧处理后NO3--N降为24.08mg/L，去除率为 33.44%。
实施例4
本实施例处理取自江苏省常州市马杭污水处理厂调节池中的废水150mL，主要进行菌液 的厌氧—缺氧流程的脱氮除磷试验，此与实施例3缺氧处理的时间不同，其余水质参数均相 同。
具体实施步骤如下：用无菌水4000r/min离心15min清洗3次后的B8菌液，再按10%投 菌量投加至待处理废水后，进行厌氧—缺氧流程处理。厌氧—缺氧流程具体操作为：将加了 菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，设置处理温度为30℃，转子搅拌培养4h，此为厌氧处 理。再将水样置于敞口容器在振荡摇床中(30℃，60r/min)每隔55min搖晃5min缺氧培养 12h后取水样，再将水样离心(8000r/min，15min)取上清液，测定水样中的TP和NO3--N 浓度。初始水样TP=4.38mg/L经4小时厌氧释磷为5.87mg/L，经12小时缺氧处理后TP降为 0.45mg/L，得到B8菌处理后的除磷率为89.73%。而在缺氧除磷过程中，初始水样 NO3--N=35.94mg/L经过4小时厌氧和12小时缺氧处理后NO3--N降为16.72mg/L，去除率为 53.48%。