申请日2014.11.14
公开(公告)日2015.06.03
IPC分类号A61P3/00; A01N63/02
摘要
本发明提供了一种用乳糖精制废水发酵制备防治植物枯萎病菌剂的方法，其工艺特点是以乳糖精制废水为主要原料，按每升废水加入氯化钾5克和经过粉碎的豆粕25克的比例，分别加入适量的氯化钾和粉碎的豆粕后搅拌均匀并调pH=7.0作为发酵原料，以2013年6月24日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株，发酵参数为：通气量每升发酵液为1升/分钟，发酵温度30℃，搅拌转速220rpm，发酵32-36小时所得到的发酵液就是一种生物菌剂。该生物菌剂不仅具有改善土壤肥力、促进光合产物的合成和定向运输，并可提供植物生长调节物质，而且所合成的抗菌物质对防治植物枯萎病具有较明显的作用，并能在一定程度上使工、农业废弃物得到合理利用，没有环境污染，价格低廉且可变废为宝，简便易行，属于生物技术领域。
权利要求书
1.一种用乳糖精制废水发酵制备防治植物枯萎病菌剂的方法，其特点是利用乳糖精制工业生产中排放的废水为主要发酵原料，加入少量豆粕和氯化钾，采用2013年6月24日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的解淀粉芽孢杆菌菌株为发酵菌株，生产制备防治植物枯萎病的生物菌剂，其工艺为：
1)取乳糖精制工业生产中排放的废水4升，按每升废水加入氯化钾5克和经过粉碎的豆粕25克的比例，在4升乳糖精制废水中分别加入氯化钾20克，粉碎的豆粕100克，搅匀调PH=7.0，放入5升发酵罐，115℃灭菌30分钟，冷却到30℃，作为发酵原料待用;
2)将保藏编号为CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的菌种活化并制备成发酵菌液：
(1)取斜面菌种一环在PDA平板上划线接菌丝，在培养箱中30℃培养48小时;
(2)取PDA平板菌落一环接入装有50ml种子培养液的250ml规格的三角瓶中，准备若干份，置于摇床，培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵菌液;
(3)种子培养液制备：按重量百分比，蛋白胨10%，酵母膏5%，氯化钾0.5%，纯净水84.5%，调PH=7.0;
3)按废水体积的5%比例将发酵菌液加入到发酵罐中，即在上述1)中含4升待用发酵原料的发酵罐中加入200ml发酵菌液，通气量每升发酵液为1升/分钟，即通气量为4L/min，发酵温度为30℃，搅拌转速220rpm，发酵时间32-36小时;
4)发酵32-36小时后的发酵液即为防治植物枯萎病的菌剂。
说明书
一种用乳糖精制废水发酵制备防治植物枯萎病菌剂的方法
技术领域
本发明以乳糖精制废水为主要原料，以2013年6月24日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株，发酵32-36小时所得到的发酵液就是一种生物菌剂，不仅具有改善土壤肥力、促进光合产物的合成和定向运输，提供植物生长调节物质，而且所合成的抗菌物质对防治植物枯萎病具有较明显的作用，并能在一定程度上使工、农业废弃物得到合理利用，没有环境污染，属于生物技术领域。
背景技术
最早发现镰刀菌能侵染香蕉引起枯萎病，它还引起西瓜、黄瓜、甜瓜等瓜类作物，茄子、辣椒、番茄、甘蓝、四季豆、豇豆等蔬菜，以及香蕉、石榴、葡萄、苹果、草莓等发生枯萎病;对农业生产造成严重影响。目前对枯萎病的防治主要采用轮作管理和化学药物灭杀，但效果有限。长期大量施用化肥，使土壤次生盐渍化和酸化趋势严重，土壤通透性和团粒结构被破坏，保水保肥能力降低也使农作物的根系和残体常年为枯萎病病原菌提供营养和着生的场所。这样化学农药难于从根本上控制枯萎病的发生，且会诱发病原菌抗药性，长期大量使用农药，也易渗透入土壤及地下水而造成环境的深度污染和瓜果农药残留。应用对环境和生物安全的微生物及所产代谢产物对枯萎病进行防治已经成为目前国际发展的主流和主要方向。
研究发现生防微生物主要通过重寄生、抗生和竞争性途径防治枯萎病，主要分真菌和细菌两大类。真菌类包括木莓、丛枝菌根真菌和非致病性镰刀 菌;细菌类主要有18个属，其中芽孢杆菌属的一些菌类效果较好，生物安全性也高，是比较理想的生防菌。早在1993年王雅平等应用枯草芽孢杆菌TG26，研究了其发酵液对西瓜枯萎病和烟草枯萎病的防治作用，发现浸根的防治效果可达100%，田间试验也具有明显促进增产作用。这类微生物不仅能产生次生代谢产物抑制或杀灭病原微生物，还能诱导植物产生系统免疫，防治植物病害。
芽孢杆菌属的一些微生物是一类非常重要的根际促生微生物，有利于改善土壤肥力、提供植物生长调节物质，许多芽孢杆菌也能合成抗菌物质，如Bacillus subtilis，Bacillus licheniformis，Bacillus pumilus，B.amyloliquefaciens B128，B.circulans ATCC 4513，Bacillus amyloliquefaciens等都可以产生脂肽类物质，Sabate′等报道，Bacillus subtilis C4所产Surfactin能拮抗类芽孢杆菌，防治蜜蜂幼虫坏死病。Tao等发现，Surfactin减轻Fengycin可以抑制软腐病病原菌葡枝根霉。Hassan等报道，可用于防治甘蔗红腐病的几种芽孢杆菌也可合成Surfactin。脂肽类物质还能诱导植物产生防御反应，从而有利于提高植物抗病性。Huang等发现，Surfactin和Iturin可杀灭桃汁中的青霉菌。可用于肉类杀灭沙门氏杆菌、牛奶杀灭大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌。Huang等报道，Bacillus cereus C1L能减轻玉米叶枯病;Ye等发现，Bacillus subtilis产生的Iturin A2能有效防治玉米叶枯病。芽孢杆菌属的微生物还可用于防治由镰刀菌引起的小麦病害。Dunlap等报道，Bacillus amyloliquefaciens AS 43.3可用于防治镰刀菌引起的穗枯病。Kumar等报道，Bacillus subtilis MBI 600能防治水稻纹枯病。芽孢杆菌属微生物对细菌性枯萎病也有较好的防治作用。Abd-Allah报道，Bacillus subtilis可用于防治花生白绢病。综上所述，芽孢杆菌属微生物不仅具有拮抗 镰刀菌引起的枯萎病，对其它真菌引起的病害和细菌性枯萎病也有较好的防治效果。但目前芽孢杆菌发酵制备技术成本较高，菌剂功能作用单一，不宜在农业领域推广应用;因此研究并建立以工农业废弃物为原料发酵制备枯萎病多功能生物防治剂，对于枯萎病生物防治剂的推广和进一步应用具有重要意义，本发明就是在这样的指导思想下，经过试验获得成功的。
发明内容
本发明首先发明以乳糖精制废水为主要原料，按每升废水加入氯化钾5克和经过粉碎的豆粕25克的比例，分别加入适量的氯化钾和粉碎的豆粕后搅拌并调PH=7.0，以2013年6月24日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株，在一定的发酵条件下发酵32-36小时所制备得到的发酵液就是一种生物菌剂，不仅具有改善土壤肥力、促进光合产物的合成和定向运输，提供植物生长调节物质，而且所合成的抗菌物质对防治植物枯萎病具有较明显的作用，并能在一定程度上使工、农业废弃物得到合理利用，没有环境污染，价格低廉且可变废为宝，简便易行。
本发明的技术方案：
用2013年6月24日保存于武汉市武昌区珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的解淀粉芽孢杆菌为发酵生产出发菌株，在乳糖精制废水中按每升废水加入氯化钾5克和经过粉碎的豆粕25克的比例，分别加入适量的氯化钾和粉碎的豆粕后搅拌并调PH=7.0作为发酵原料，在一定的发酵条件下发酵32-36小时生产制备的发酵液即为防治植物枯萎病菌剂，工艺为：
1)取乳糖精制工业生产中排放的废水4升，加入豆粕100克，氯化钾20克，搅匀，调PH=7.0，放入5升发酵罐，115℃灭菌30分钟，冷却到30℃，待用。
2)将保藏编号为：CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的菌种活化并制备成发酵菌液：
(1)取斜面菌种一环在PDA平板上划线接菌丝，在培养箱中30℃培养48小时。
(2)取PDA平板菌落一环接入装有50ml种子培养液的250ml规格的三角瓶中，准备若干份，置于摇床，培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵菌液。
(3)种子培养液制备：按重量百分比，蛋白胨10%，酵母膏5%，氯化钾0.5%，纯净水84.5%，调PH=7.0。
3)按废水体积的5%加入发酵菌液到发酵罐中，即在上述含4升废水的发酵罐中加入200ml发酵菌液，通气量每升发酵液为1升/分钟，发酵温度30℃，搅拌转速220rpm，发酵时间32-36小时。
4)发酵32-36小时后的发酵液即为防治植物枯萎病的菌剂。
本发明的有益效果：
尽管植物枯萎病的发现已经有一百多年的历史，其治理主要以田间管理和施用化学农药为主;生物农药的推广施用还未见报道。其主要限制因素是生产成本问题，而利用工业、农业、生活废弃物发酵制备拮抗枯萎病的菌剂则是解决成本问题的及有效手段，关于这方面的研究和应用尚未见报道，尤其是利用废水中的营养物质生产菌剂，既可以节省废水治理成本、还可以直接出产品，用于农业推广应用。
增加产品的功能和质量是降低成本的另一重要手段，农作物叶面喷施剂是改善作物生长发育，尤其是果实、种子生长发育的中药制剂，通过发酵调控使 有益微生物产生有利于叶片光合作用、促进光合产物向果实转移和刺激果实生长发育的次生代谢产物，来改善和提高枯萎病的功能无疑对提高生物防护剂的功能具有现实意义，这方面的研究尚未见报道。
而本发明的方法，不仅治理解决了精制乳糖的工业废水，且变废为宝，将它作为2013年6月24日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的解淀粉芽孢杆菌微生物发酵的原料，生产制备出具有改善土壤肥力、促进光合产物的合成和定向运输，提供植物生长调节物质，且所合成的抗菌物质对防治植物枯萎病具有较明显的作用的生物菌剂，绿色环保，没有废弃物，大大降低了生产成本，具有广阔的应用前景、较好的经济效益和社会效益，具体详细的作用机理研究报告将在以后的博士论文中陈述。
具体实施方式
实施例1
1)取乳糖精制工业生产中排放的废水4公斤，加入豆粕100克，氯化钾20克，搅匀，调PH=7.0，放入5升发酵罐，115℃灭菌30分钟，冷却到30℃，待用。
2)将保藏编号为：CCTCC M 2013283的Bacillus amyloliquefaciens H47的菌种活化并制备成发酵菌液：
(1)取斜面菌种一环在PDA平板上划线接菌丝，在培养箱中30℃培养48小时。
(2)取PDA平板菌落一环接入装有50ml种子培养液的250ml规格的三角瓶中，准备若干份，置于摇床，培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵菌液。
(3)种子培养液制备：按重量百分比，蛋白胨10%，酵母膏5%，氯化钾0.5%，纯净水84.5%，调PH=7.0。
3)按废水体积的5%加入发酵菌液到发酵罐中，即在上述含4升废水的发酵罐中加入200ml发酵菌液，通气量每升发酵液为1升/分钟，发酵温度30℃，搅拌转速220rpm，发酵时间32-36小时。
4)发酵32-36小时后的发酵液即为防治植物枯萎病的菌剂。