申请日2015.07.20
公开(公告)日2015.10.07
IPC分类号C12N1/20; C12N1/14; C12R1/685; C12R1/19; C12R1/07; C05F7/00
摘要
本发明公开了一种用于污泥处理的复合微生物菌剂及其制备方法，该菌剂是由大肠杆菌、芽孢杆菌以及黑曲霉菌、按照重量份为1～5：0～2：0～3的比例制成的一种复合菌剂，并将该复合微生物菌剂与污泥混合物进行堆肥处理，污泥在一定长的时间内产生发酵、升温并熟化，通过提高温度的作用有效杀灭污泥中的有害微生物和病原体，使很大一部分水分得到蒸发，将重金属从可溶态变为不可溶态，从而获得符合农用要求的有机肥。
权利要求书
1.一种用于污泥处理的复合微生物菌剂，其特征在于，该菌剂是 由大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)以及黑曲霉菌(Aspergillus niger)按照重量份为1～5：0～2：0～3的比例制成的一种复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于污泥处理的复合微生物菌剂，其特 征在于，所述大肠杆菌、芽孢杆菌以及黑曲霉菌按照重量份比例为2：1：1 制成。
3.制备权利要求1或2所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在 于，该方法由以下步骤组成：
a、大肠杆菌的培养：称取15g营养肉汤培养基于500ml蒸馏水中，经 振荡搅拌后放入立式压力蒸汽灭菌器内杀菌消毒，开启超净工作台后打开 紫外线进行杀菌30min，待高压杀菌后，取出培养基放置到超净工作台中， 等培养基的温度降到50℃左右，在无菌的条件下，将大肠杆菌接种到培养 基中，接种好大肠杆菌后放入智能生化培养箱中并将培养箱温度调至37℃， 培养12h;
b、芽孢杆菌的培养：称取15g营养肉汤培养基于500ml蒸馏水中，经 振荡搅拌后放入立式压力蒸汽灭菌器内杀菌消毒，开启超净工作台后打开 紫外线进行杀菌30min，待高压杀菌后，取出培养基放置到超净工作台中， 等培养基的温度降到50℃左右，在无菌的条件下，将芽孢杆菌接种到培养 基中，接种好芽孢杆菌后放入智能生化培养箱中并将培养箱温度调至37℃， 培养12h;
c、黑曲霉菌的培养：将培养工作中需要用到的接种环和酒精灯以及其 它器具放置到超净工作台中，开启超净工作台，打开紫外灯，照射30min 左右关闭紫外灯，开启通风装置，将黑曲霉菌挑取接种到准备好的PD培养 基中，制成黑曲霉的悬浮液，制成的悬浮液在30℃，150r/min环境下于摇 床中培养7d，培养结束后的悬浮液放置于4℃冰箱中保存备用;
d、混合培养：在混合培养之前，需要将三种菌分别进行活化，然后检 测三种菌的活菌数，待每个菌的活菌数大于等于1×108个/ml后，分别用移 液器取出，然后按照大肠杆菌、芽孢杆菌以及黑曲霉菌的重量比为2：1：1 比例接种到固体培养基中，混合均匀，共同置于37℃的培养箱中培养12h。
说明书
一种用于污泥处理的复合微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于污泥处理技术领域，具体涉及一种用于污泥处理的复合微 生物菌剂及其制备方法。
背景技术
随着经济快速的发展以及污水的处理率普及，我国大部分城市污水处 理的量大幅度的增加，污水处理厂污泥的产量也迅速攀升。在我国的城市 水污染治理中，污水处理厂污泥处理处置用度约占工程投资和运行费的 25%-45%。污水处理厂污泥处理处置高昂的投资及其运行用度，一方面使得 目前国内大部分污水处理厂未对污泥进行稳定处理或处理工艺的配套设施 不完善，另一方面也使得建有完善污泥处理设施的污水处理厂常因其运行 用度较高而基本停用。随着我国城市污水处理设施的普及，处理率的进步 和处理程度的深化，污泥的产生量将有较大的增长，预计到2020年，我国 中小城市污水处理厂的湿污泥年产量将达2000余万吨，污泥的处理处置将 成为困难。
我国产生的污泥约48.28%土地利用、填埋34.48%、焚烧3.45%、13.79% 未进行合理处置。绝大部分的污泥仅脱水后随意处理，没有到达稳定化、 无害化处置后的污水污泥将会产生大量的臭气，对国家土壤、水体、生态 环境造成污染和破坏，已经变成非常严峻的社会环境问题。现有技术中常 见的污泥处理方式有：厌氧消化、干化焚烧。污泥处置方式有土地利用、 填埋、综合利用，具体如下：
1)厌氧消化：污泥厌氧消化是指在无氧条件下，由兼性菌和厌氧菌将 污泥中可生物降解的有机物分解成二氧化碳、甲烷和水等稳定的物质，同 时减小污泥体积，去除臭味，杀死寄生虫卵，回收利用消化过程中产生的 沼气的过程。污泥厌氧消化以其高效的能量回收和较低的环境影响是目前 国际上应用最为广泛的污泥稳定化和资源化的处理方法。但是目前的厌氧 消化在技术性能、运行效果、设备加工质量、自动控制水平等均不合人意。
2)干化焚烧：污泥焚烧是指在空气供给过量的条件下，将污泥加热， 并高温(850℃-1100℃)氧化、热解并彻底破坏其中的有机物和病原体等 物质的方式。焚烧装置有多种型式，目前使用较多的有竖式多级焚烧炉、 转筒式焚烧炉、流化焚烧炉等。为了实现节能目的，需要将污泥先干化， 大幅降低其含水率后再进行焚烧。但是目前由于对大气污染控制的技术瓶 颈依然存在，制约了干化焚烧的推广范围和应用规模。
3)土地利用：土地利用是指将污泥直接或间接(经过好氧发酵或厌氧 消化后)应用于农田、菜地、果园、草坪、绿化以及土壤改良，或将达到 一定标准的污泥用作填埋场的覆盖土。但是由于污泥的成分非常复杂，尤 其是重金属和持久性有机污染物含量较高，进而造成污泥土地利用的环境 风险。
发明内容
本发明为了克服现有技术中的不足，提供了一种用于污泥处理的复合 微生物菌剂及其制备方法，主要是利用由不同功能的大肠杆菌、芽孢杆菌 以及黑曲霉菌组成的复合微生物菌剂，在自然堆肥条件下，使污泥在一定 长的时间内产生发酵、升温并熟化，通过提高温度的作用有效杀灭污泥中 的有害微生物和病原体，使很大一部分水分得到蒸发，将重金属从可溶态 变为不可溶态，从而获得符合农用要求的有机肥，实现废物循环利用。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种用于污泥处理的复合微生物菌剂，该菌剂是由大肠杆菌 (Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)以及黑曲霉菌(Aspergillus niger) 按照重量份为1～5：0～2：0～3的比例制成的一种复合菌剂。
进一步地，所述大肠杆菌、芽孢杆菌以及黑曲霉菌按照重量份比例为2： 1：1制成。
本发明中复合微生物菌剂的制备方法，由以下步骤组成：
a、大肠杆菌的培养：称取15g营养肉汤培养基于500ml蒸馏水中，经 振荡搅拌后放入立式压力蒸汽灭菌器内杀菌消毒，开启超净工作台后打开 紫外线进行杀菌30min，待高压杀菌后，取出培养基放置到超净工作台中， 等培养基的温度降到50℃左右，在无菌的条件下，将大肠杆菌接种到培养 基中，接种好大肠杆菌后放入智能生化培养箱中并将培养箱温度调至37℃， 培养12h;
b、芽孢杆菌的培养：称取15g营养肉汤培养基于500ml蒸馏水中，经 振荡搅拌后放入立式压力蒸汽灭菌器内杀菌消毒，开启超净工作台后打开 紫外线进行杀菌30min，待高压杀菌后，取出培养基放置到超净工作台中， 等培养基的温度降到50℃左右，在无菌的条件下，将芽孢杆菌接种到培养 基中，接种好芽孢杆菌后放入智能生化培养箱中并将培养箱温度调至37℃， 培养12h;
c、黑曲霉菌的培养：将培养工作中需要用到的接种环和酒精灯以及其 它器具放置到超净工作台中，开启超净工作台，打开紫外灯，照射30min 左右关闭紫外灯，开启通风装置，将黑曲霉菌挑取接种到准备好的PD培养 基中，制成黑曲霉的悬浮液，制成的悬浮液在30℃，150r/min环境下于摇 床中培养7d，培养结束后的悬浮液放置于4℃冰箱中保存备用;
d、混合培养：在混合培养之前，需要将三种菌分别进行活化，然后检 测三种菌的活菌数，待每个菌的活菌数大于等于1×108个/ml后，分别用移 液器取出，然后按照大肠杆菌、芽孢杆菌以及黑曲霉菌的重量比为2：1：1 比例接种到固体培养基中，混合均匀，共同置于37℃的培养箱中培养12h。
本发明中的微生物菌剂由不同功能的微生物组合成复合微生物菌剂， 各种微生物菌剂之间相互依存，相互提供营养和代谢环境条件。这三种微 生物菌的具体介绍如下：
1)大肠杆菌(Escherichia coli)：大肠杆菌属于原核生物，它的代谢类 型是异养兼性厌氧型，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的 细胞器，没有细胞核有拟核。
2)芽孢杆菌(Bacillus)：它的特性为：代谢快、繁殖快;生命力强， 无湿状态可耐低温-60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、 耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厌氧繁殖);体积比一般病源菌分子大四倍 数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。它的功能为：保湿性强：形 成强度极为优良的天然材料聚麸胺酸，为土壤的保护膜，防止肥份及水份 流失;有机质分解力强：增殖的同时，会释出高活性的分解酵素，将难分 解的大分子物质分解成可利用的小分子物质;产生丰富的代谢生成物：合 成多种有机酸、酶、生理活性等物质，及其它多种容易被利用的养份;抑 菌、灭害力强：具有占据空间优势，抑制有害菌、病原菌等有害微生物的 的生长繁殖;除臭：可以分解产生恶臭气体的有机物质、有机硫化物、有 机氮等，大大改善场所的环境。
3)黑曲霉菌(Aspergillus niger)：它的生长适温37℃，最低相对湿度 为88%，黑曲霉菌丝直径15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形 成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色 的球状，直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。 蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略 带黄褐色。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。菌丝呈黑褐色，顶囊 大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。对紫 外线以及臭氧的耐性强。菌丝发达，多分枝，有多核的多细胞真菌。分生 孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞(足细胞)上垂直生出。在发酵 工业主要用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化 酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。
本发明具有如下优点：
1、经过大量的实验研究，以玉米秸秆、木屑为添加剂对城市污水厂脱 水污泥进行堆肥，完全可以达到卫生化和稳定化的要求，污泥堆肥熟料中 含有大量的经驯化的微生物，以玉米秸秆、木屑作为堆肥添加剂，不仅可 以使污泥中的有机物分解更加彻底，还可以提高反应启动速度，缩短堆肥 时间;
2、由不同功能的大肠杆菌、芽孢杆菌以及黑曲霉菌组成的复合微生物 菌剂作为外源菌添加剂使用，简化了工艺流程，可大大降低运行成本，为 污泥堆肥规模化应用提供技术基础，对于解决我国大多数城市污水厂污泥 问题具有重要意义;
3、污泥与复合微生物制剂混合堆肥，有效降低重金属的活性成分含量， 提高了有机肥的安全性，同时混合堆肥有机质的N、P、K含量丰富，经后 续加工后可以考虑作为园林绿化的营养土、有机肥基质等。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例 仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
值得说明的是，为更清楚的说明和解释本实施例，本实施例采用实验 的方法进行阐述，同时为了便于对比和说明，本实施例采用了四组实验进 行介绍。
实验中的主要试剂有：污泥、玉米秸秆、木屑、大肠杆菌样品、芽孢 杆菌样品(枯草)、黑曲霉菌样品、营养肉汤培养基、LB营养琼脂、伊红 美蓝培养基、麦康凯培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。
实验中的主要实验仪器有：立式压力蒸汽灭菌器、FORMA超净工作台、 DHG-9241A型电热恒温干燥箱、恒温摇床、电子天平、微量移液器、冰箱、 智能生化培养箱、氮磷钙测定仪、若干培养皿及实验室常用玻璃器材。
本实验是前往兰州市西固污水处理厂采集剩余污泥，并进行好氧堆肥。 实验中的污泥主要组成为具有活性的微生物、微生物代谢产物和吸附在其 表面而难以降解或未分解的无机物、有机物，污泥中有丰富的营养元素N、 P、K和微量元素等，主要成分如表1所示：
含水率 有机质 总氮 总磷 总钾 蛔虫卵 有害菌(×104个/ml) 85.51% 46.14 2.94 1.71 1.35 13 300
表1 为本实验中采用的污泥的基本性质。
在本实验中，选取玉米秸秆、木屑与上述采集到的污泥混合进行好氧 发酵，该污泥混合物是由污泥、玉米秸秆以及木屑按照重量比为6：1：1 进行配置。堆肥容器为600mm长、直径、壁厚为550mm×2.5mm发酵筒， 外层用塑料膜包好，插在泡沫板层中;堆肥体积离筒口50mm。具体地： 第一步先量取一定质量的污泥加入发酵筒内;第二步加玉米秸秆，玉米秸 秆磨碎，按比例称取加入污泥，用搅拌器42r/min搅拌均匀;第三步加木屑， 按比例称取加入污泥，用搅拌器42r/min搅拌均匀。
在本实验中，复合微生物菌剂由大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆 菌(Bacillus)以及黑曲霉菌(Aspergillus niger)组成，共计3株。
复合微生物菌剂的制备方法为：
a、大肠杆菌的培养：
首先称取15g营养肉汤培养基于500ml蒸馏水中，经振荡搅拌后放入 立式压力蒸汽灭菌器内杀菌消毒，开启超净工作台后打开紫外线进行杀菌 30min，待高压杀菌后，取出培养基放置到超净工作台中，等培养基的温度 降到50℃左右，在无菌的条件下，将大肠杆菌接种到培养基中，接种好大 肠杆菌后放入智能生化培养箱中并将培养箱温度调至37℃，培养12h。
大肠杆菌培养结束前制作固体培养基，取20gLB营养琼脂于500ml蒸 馏水中和若干培养基放入立式压力灭菌器杀菌消毒后，在超净工作台中将 培养基倒入数个培养皿中，待培养基凝固后，将培养好的大肠杆菌分三个 浓度梯度10-1、10-2、10-3接种到固体培养基中，再放入智能生化培养箱37℃ 条件下培养12h。
然后进行大肠杆菌的分离鉴定：本实验采用革兰氏染色方法进行染色 镜检。
分离是在超净工作台中进行操作的，将培养好的3个浓度梯度的大肠 杆菌依次划线后接种，分别接种于伊红美蓝培养基和普通琼脂培养基上， 在智能生化培养箱中37℃培养12h;再从伊红美蓝培养基上挑取出可疑的 菌落后，再次划线接种在麦康凯培养基平板上，再放入智能生化培养箱中 37℃培养12h;观察结果表现为，三个浓度梯度的大肠杆菌均能再(在)普 通琼脂培养基上表现为形凸出、潮湿、滑润、稍透明、白灰色菌体;三个 浓度梯度的大肠杆菌均能在伊红美蓝培养基上表现为紫黑色并且带有金属 色泽的近圆形状菌体;三个浓度梯度在麦康凯培养基上形成红色圆形菌落。
染色镜检：挑取麦康凯培养基上的可疑菌落，按革兰氏染色方法，进 行染色镜检;对培养物进行涂片和染色，结果观察为镜检中发现前后两段 近似圆形，大部分散在排列，革兰氏阴性短杆菌。
生化鉴定实验：通过超净工作台用接种针选出培养基上边的嫌疑菌体， 挑选完毕后再依次接种到几种实验室细菌喂料发酵管里，稍微倾斜发酵管 再放置到智能生化培养箱中，37℃培养12h至24h;三个浓度梯度大部分菌 株能发酵木糖、乳糖、葡萄糖，产酸不产气、产气不产酸;大多数的菌株 在吲哚实验显现为阳性。
菌落计数：将培养好之后的三个浓度梯度10-1、10-2、10-3菌落数目结 果分别为多不可计、176、23;根据菌落计数原则，原培养基中的菌落总数 可记为1.8×104/ml。
b、芽孢杆菌的培养：
首先称取15g营养肉汤培养基于500ml蒸馏水中，经振荡搅拌后放入 立式压力蒸汽灭菌器内杀菌消毒，开启超净工作台后打开紫外线进行杀菌 30min，待高压杀菌后，取出培养基放置到超净工作台中，等培养基的温度 降到50℃左右，在无菌的条件下，将芽孢杆菌接种到培养基中，接种好芽 孢杆菌后放入智能生化培养箱中并将培养箱温度调至37℃，培养12h。
芽孢杆菌培养结束前制作固体培养基，取20gLB营养琼脂于500ml蒸 馏水中和若干培养基放入立式压力灭菌器杀菌消毒后，在超净工作台中将 培养基倒入数个培养皿中，待培养基凝固后，将培养好的芽孢杆菌分三个 浓度梯度10-1、10-2、10-3接种到固体培养基中，再放入智能生化培养箱37℃ 条件下培养12h。
然后进行芽孢杆菌的分离鉴定：分离是在超净工作台中操作的，将3 个浓度梯度的芽孢杆菌接种到制作好的牛肉汤蛋白胨培养基平板上，用涂 布棒均匀涂布，在智能生化培养箱中，37℃培养24h;从牛肉汤蛋白胨培养 基平板里，依次挑取出2个单菌落中的一部分，在平板上进行划线及纯化， 再对菌体的特征进行镜检，结果为菌体为杆状，带有芽孢，宽度均一，菌 体的色泽、外形、质体、透光性全部接近一致，试验结果可以确定其为芽 孢杆菌，然后再从中挑取一株接种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基，放置智能 生化培养箱中37℃培养24h备用。
芽孢杆菌鉴定：本实验采用淀粉水解方法;绝大部分的芽孢杆菌可以 自身分解产生淀粉酶，产生的淀粉酶可以把培养基里含有的淀粉发生水解 反应，产生无色的糊精等等分子物质，或者接着进行水解反应，分解成葡 萄糖少部分麦芽糖，产生的淀粉进行水解后产生物，与碘反应不变为蓝色; 接着在肉汤琼脂里加入0.2%可溶性的淀粉，再分别装在三角瓶里面，在将 三角瓶放于立式压力蒸汽灭菌器杀菌灭度后，降温到50℃左右后，制作平 板，待平板凝固再取分离纯化结束的菌体接种于平板，然后放于智能生化 培养箱置37℃培养24h，待培养基形成菌落，然后于平板上滴入碘液，铺 满菌落，结果表现为：其平板显现为蓝色，其菌体周边有多种颜色的透明 带产生，现象表明淀粉进行了水解，根据透明带的程度，能够判断其水解 的程度。
菌落计数：将培养好之后的三个浓度梯度10-1、10-2、10-3菌落数目结 果分别为多不可计、295、46;根据菌落计数原则，原培养基中的菌落总数 可记为3.8×104/ml。
c、黑曲霉菌的培养：将将培养工作中用到的接种环和酒精灯以及其它 器具放置到超净工作台中，开启超净工作台，打开紫外灯，照射30min左 右关闭紫外灯，开启通风装置，将黑曲霉菌挑取接种到准备好的PD培养基 中，制成黑曲霉的悬浮液，制成的悬浮液在30℃，150r/min环境下于摇床 中培养7d，培养结束后的悬浮液放置于4℃冰箱中保存备用。
d、混合培养：
在混合培养之前，将培养好的三种菌分别进行活化，其中：
大肠杆菌、芽孢杆菌活化的具体步骤如下：
从–80℃取出一支保存的菌液，用移液器吸取200μL菌液，用玻璃珠左 右晃动使菌液铺匀，将平板正向放入37℃培养箱中20min后，再将平板倒 扣，继续培养12h。然后挑取平板上的较大而光滑的单个菌落，接种到6mL 含LB液体培养基中，置于37℃摇床中，220r/min振摇培养10.5h。
黑曲霉菌的活化：
将保存的黑曲霉接到改良马丁培养基摇瓶中，振荡培养约5-6天(23～ 30℃培养)。
在完成活化后，检测三种菌的活菌数，待每个菌的活菌数大于等于1 ×108个/ml后，分别用移液器取出，然后按照大肠杆菌、芽孢杆菌以及黑 曲霉菌的重量比为2：1：1比例接种到固体培养基中，混合均匀，共同置 于37℃的培养箱中培养12h。
以下具体地阐述污泥混合物与复合微生物菌剂发酵的对比实验：
首先将由污泥、玉米秸秆以及木屑按照重量比为6：1：1配置形成的 污泥混合物等量地放入A、B、C、D四个发酵筒中进行发酵。
然后将大肠杆菌、芽孢杆菌、黑曲霉菌按一定比例与污泥混合物混合 发酵，其中：
A发酵筒中，大肠杆菌：芽孢杆菌：黑曲霉菌=2：1：1
B发酵筒中，大肠杆菌：芽孢杆菌：黑曲霉菌=1：2：1
C发酵筒中，大肠杆菌：芽孢杆菌：黑曲霉菌=1：1：2
D发酵筒中，空白组
然后将A、B、C三个发酵筒进行发酵49d，并在0d，3d，6d，9d，......， 45d翻堆并取样。
在污泥混合物发酵过程中会产生温度变化，值得说明的是，温度的高 低是污泥堆肥过程中微生物生命活动的标准指标，污泥进行堆肥的主要目 的是为了使堆体的温度迅速升高，并在合适的温度保持一段时间，促使有 机物进行降解并且消灭其中的病原菌。