申请日2016.03.27
公开(公告)日2016.07.20
IPC分类号C02F3/34; C07K14/32
摘要
本发明属于污水处理领域，公开了一种去除污水中石油的方法，该方法中将红平红球菌和铜绿假单胞菌按比例配合混合菌，加入营养盐氮源和磷源即可降解石油。本发明的主要采用微生物来处理污染物，能够有效地去除含有石油的污染物，并且投入成本低，降解石油快，具备较好的应用前景。
权利要求书
1.一种去除污水中石油的方法，(1)将待处理的水体引入处理池;(2)将红平红球菌和铜绿假单胞菌按1∶1比例配合混合菌，将菌液接入总石油烃起始含量为9000mg/L污水中，接菌量为2.0×109~3.5×109个/L污水，再加入1000~2000mg/kg生物表面活性剂，加入营养盐氮源和磷源;在30℃下降解35天。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的红平红球菌为导入了编码Genbank：AJW87477.1所示蛋白的基因或者导入的基因所编码的蛋白为相对AJW87477.1所示蛋白仅存在31g/s、62d/k、130i/g、165h/g、182a/s、244d/a、263s/r、271g/p、279i/v、302e/s、365l/m、372k/g、383a/s、409k/a、419w/t、423e/v任何一个的取代。
3.一种蛋白变体，其序列为在野生蛋白的基础上仅存在31g/s、62d/k、130i/g、165h/g、182a/s、244d/a、263s/r、271g/p、279i/v、302e/s、365l/m、372k/g、383a/s、409k/a、419w/t、423e/v任何一个的取代，所述野生蛋白序列如Genbank：AJW87477.1所示。
说明书
一种处理石油污水的方法
技术领域
本发明属于环保技术领域，具体涉及一种去除石油污水中石油的方法。
背景技术
石油是现代社会主要的能源之一，素有"工业血液"之称。石油是由上千种化学性质不同的物质组成的复杂混合物，主要包括饱和烃、芳香烃类化合物、浙青质、树脂类等。现在产油的国家和地区已有150多个，发现的油气田4万多个。其中我国找到的有400多个，年产石油近2亿吨，是世界十大产油国之一。然而，石油在开采、冶炼和运输过程中会因为突发事故、泄露或操作不当，以及含油废水的排放、污水灌溉，各种石油制品的挥发、不完全燃烧物飘落等引起一系列水源的石油污染问题。特别是石油开采过程产生的落地原油，已成为水源污染的重要来源。
许多研究表明，一些石油烃类进入动物体内后，对哺乳类动物及人类有致癌、致畸、致突变的作用。水源的严重污染会导致石油烃的某些成分在粮食中积累，影响粮食的品质，并通过食物链，危害人类健康。
目前石油污染物的净化处理主要有化学、物理和生物三种途径。化学方法主要利用化学萃取剂消除石油污染物。特别是在邮轮或钻井平台发生事故初期是很有效的做法。但是化学萃取剂对于水生生态物种来说大多是有害的，其副作用比石油污染泛滥的直接经济损失还要严重，因此不少国家已经禁止使用这一方法。物理方法是通过一些器械或添加物对石油污染进行吸附收集等，这类装置已经发展了许多类型，去除效果好，但是昂贵的设备费用限制了其广泛使用，且在寒冷的季节效果较低。另外还可以投家一些对石油污染具有一定净化能力、本身对动植物没有损害的物质进行吸附，普遍使用的投加剂为锯末、粉碎的浮石粉和玉米粉等。
生物方法及石油污染生物修复，是指利用微生物及其他生物，将存在于土壤的石油污染物降解成二氧化碳和水或转化为无害物质的工程技术系统。与物理、化学修复相比，生物修复具有非破坏性、经济性和安全性的特点，生物修复被认为是修复污染土壤的最优选择。为了取得高效、彻底的生物修复效果，分离和筛选污染物的高效降解菌是生物修复的必然要求。因此，开发一种具有高效的降解石油能力的工程菌显得迫在眉睫。
发明内容
为了克服现有技术的不足，有效简单地去除污水中的石油污染物，本发明提供了一种去除污水中石油的方法，其技术方案是通过如下方法实现的:
一种去除污水中石油的方法，其包括如下步骤:(1)将待处理的水体引入处理池;(2)将红平红球菌和铜绿假(甲)单胞菌按1∶1比例配合混合菌，将菌液接入总石油烃起始含量为9000mg/L污水中，接菌量为2.0×109～3.5×109个/L污水，再加入1000～2000mg/kg生物表面活性剂，加入营养盐氮源和磷源;在30℃下降解35天。
本发明所述的菌为本领域公知的菌，均可以从CGMCC、CCTCC以及美国模式培养物集存库(ATCC)等商业途径购买得到。其中红平红球菌可以为CCTCCM205068。
本发明同时提供一种能够高效祛除石油的转基因菌株，该菌株通过将氨基酸序列如Genbank：AJW87477.1所示的序列导入到红平红球菌中实现其目的。所述基因是从枯草芽孢杆菌中分离获得的。其氨基酸序列如下：
并且所述的氨基酸序列可以具有如下位点的突变，31g/s、62d/k、130i/g、165h/g、182a/s、244d/a、263s/r、271g/p、279i/v、302e/s、365l/m、372k/g、383a/s、409k/a、419w/t、423e/v。121h/g、181i/s(31g/s表示在原始序列第31位的g氨基酸替换为s氨基酸)。这些突变后的氨基酸序列使得导入了该突变后的氨基酸序列的菌株同样具有相似的甚至更好的效果。而申请人通过大量的实验证实，并不是所有的取代都具有相似的效果，有大量的取代之后并不具有所述的效果。
利用DNAMAN软件设计引物，分别加入了酶切位点，根据氨基酸序列Genbank：AJW87477.1全基因合成所述的核苷酸序列AJW基因，通过进行扩增获得目的片段，PCR扩增获得目的基因AJW(同时通过多重PCR将相应的突变位点引入到基因序列中，从而获得了不同突变体基因)，用限制性内切酶进行双酶切PCR产物，与同样经过双酶切的穿梭表达质粒pRESl相连，将验证成功的重组质粒转化进入到所述红平红球菌中，获得降解石油的基因工程菌。
本发明中所述的穿梭表达质粒pRESl,由来源于大肠杆菌的质粒pUC18和来源于红平红球菌PR4的质粒pREC2酶切后连接而成，具体的将来源于大肠杆菌的质粒PUC18和来源于红平红球菌PR4的质粒PREC2分别用SspI和Agel单酶切，并将粘性末端补齐后用T4连接酶连接构建出大肠杆菌-红平红球菌穿梭载体pRESl，其已经是现有技术。
本发明的各菌种的扩大培养均为本领域的常规培养方式，也可以参照文献中记载的培养方式获得。
本发明取得的主要有益效果如下:本发明采用微生物菌处理含有石油的污水，有效地净化了污水，具有节约时间、降低成本的效果，具有较好的应用前景。