申请日2016.09.19
公开(公告)日2017.03.01
IPC分类号G01N30/02; G01N30/06; G01N30/08; G01N30/72
摘要
本发明提供了一种同时检测土壤中11种抗生素的方法，采用UPLC‑MS/MS方法检测抗生素，以加标法确定检测方法的回收率。方法主要包括土壤中抗生素的提取，抗生素的萃取与富集，抗生素检测三个部分。本方法主要步骤如下:(1)样品的采集与保存:采集0~20cm表层土壤，加冰袋保持低温,避光保存。取回的土样冷干，研磨，过40目筛，称取1g土壤进行抗生素的提取。(2)采用SAX与HLB小柱串联的形式对提取的抗生素进行萃取纯化，用10ml甲醇洗脱，氮吹至尽干富集，纯甲醇定容至1ml与进样小瓶中。(3)UPLC/MS/MS检测。本方法采用的提取液是乙腈与PH=3的磷酸缓冲溶液之比为7:3，10 ml，超声提取3次，上清液合并经过SAX与HLB小柱固相萃取，高纯氮氮吹尽干，甲醇定容至1ml，UPLC‑MS/MS方法检测。
权利要求书
1.一种快速高效同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)土壤、污泥样品的采集、保存与前期处理
采集0~20 cm表层土壤在-20 ℃条件下避光保存，对于底泥，采集保存时注意赶出空气，使用冷冻干燥机冷干，研磨过40目筛子，-20 ℃冷藏;
(2)配制土壤、污泥抗生素提取液
称取含有两个结晶水的磷酸二氢钠3.12 g，加入200 μl浓磷酸，用超纯水定容至100ml，得到pH=3的磷酸缓冲溶液;将色谱级乙腈与磷酸缓冲溶液按照体积比7：3混合，得到土壤提取液。
(3)提取土壤、污泥中抗生素
称取土壤或污泥样品1 g(精确到0.0001 g)于50 ml离心管中，依次加入0.2 g Na2EDTA和10 mL土壤、污泥抗生素提取液(见(1))，涡旋1分钟，超声10分钟，离心(8000转)15分钟，收集上清液，此过程共重复3次，将得到的上清液合并后，用超纯水稀释至400ml，使用0.45μm有机相微孔滤膜抽滤，
(4)固相萃取富集并浓缩抗生素
使用SAX和HLB小柱进行固相萃取：将SAX柱和HLB柱通过SPE连接柱小件连接起来置于固相萃取真空装置上，依次使用6 ml色谱级甲醇和6 mL超纯水对小柱进行活化和冲洗，随后，使用大容量采样管将抗生素提取液(见(2))与固相萃取柱连接，打开真空泵进行固相萃取，结束后，用超纯水清洗固相萃取小柱，真空干燥30分钟，弃去SAX小柱，使用2×5 mL色谱级甲醇将抗生素从HLB小柱中洗脱于15 mL试管中，50℃水浴条件下高纯氮气吹至近干，添加1 mL色谱级甲醇再次溶解抗生素后，使用0.22 μm针式滤膜转移至2 mL进样小瓶中，上机测定，
(5)UPLC/MS/MS检测
将待测提取液通过UPLC/MS/MS(沃特世科技(上海)有限公司)进行分析检测，测定的色谱条件为：采用BEH-C18色谱柱，2.1×100 mm，二元梯度泵(沃特世科技(上海)有限公司);MS/MS检测器(沃特世科技(上海)有限公司);流动相A为0.5%的甲酸，流动相B为乙腈;进样体积10 μL;流速0.4 mL/min;柱温50℃;梯度洗脱顺序：0~1.5 min，90%~84% A;1.5~2 min，84%~82% A;2~2.5 min，82%~80% A;2.5~3 min，80%~78% A;3~4 min，78%~65% A;4~4.5min，65%~40% A;4.5~5 min，40% A;5~6.5 min，40%~5% A;6.5~7 min，5%~90% A;7~10 min，90% A，
质谱条件为：氯霉素采用负离子模式，锥孔电压34 V，碰撞电压16 V，定性判定母离子质荷比为321.00，子离子质荷比为151.97;氟苯尼考采用负离子模式，锥孔电压16 V，碰撞电压18/8 V，定性判定母离子质荷比为356.03，子离子质荷比为185.05/336.00;呋喃唑酮采用正离子模式，锥孔电压46 V，碰撞电压20/22 V，定性判定母离子质荷比为226.07，子离子质荷比为67.08/122.06;恩诺沙星采用正离子模式，锥孔电压10 V，碰撞电压24 V，定性判定母离子质荷比为360.2603，子离子质荷比为342.2815; 氧氟沙星采用正离子模式，锥孔电压为12 V，碰撞电压为30 V，定性判定母离子质荷比为362.2395，定性判定子离子质荷比为261.2175/318.2567;土霉素采用正离子模式，锥孔电压为10 V，碰撞电压为26 V，定性判定母离子质荷比为461.2439，定性判定子离子质荷比为426.2635;红霉素采用正离子模式，锥孔电压为6 V，碰撞电压为34/34 V，定性判定母离子质荷比为734.4931，定性判定子离子质荷比为158.1931/576.5374;磺胺嘧啶采用正离子模式，锥孔电压为6 V，碰撞电压为24 V，定性判定母离子质荷比为251.1482，定性判定子离子质荷比为156.0689;磺胺甲恶唑采用正离子模式，锥孔电压为4 V，碰撞电压为24 V，定性判定母离子质荷比为254.148，定性判定子离子质荷比为156.0694;氨苄青霉素采用正离子模式，锥孔电压为32 V，碰撞电压为16/16 V，定性判定母离子质荷比为350.08，定性判定子离子质荷比为106.1/174.06;四环素采用正离子模式，锥孔电压为4 V，碰撞电压为24/22 V，定性判定母离子质荷比为445.249，定性判定子离子质荷比为154.1075/410.1938，
(6)计算分离出的抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出抗生素含量。
2.根据权利要求1所述的高效快速同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法，其特征在于：在前期处理中加入Na2EDTA。
3.根据权利要求1所述的高效快速同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法，其特征在于：提取液采用乙腈与pH=3的磷酸缓冲溶液体积比为7:3，涡旋、超声和离心提取，提取3次合并上清液，采用SAX和HLB小柱串联的形式对提取液进行固相萃取分离。
4.根据权利要求1所述的高效快速同时检测土壤、污泥中多种类抗生素含量的方法，其特征在于：采用UPLC/MS/MS检测，流动相采用0.5%甲酸和乙腈，随着分离时间调整流动相比例，以达到最好的分离效果。
5.根据权利要求1所述的高效快速同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法，其特征在于： 10分钟内可以完成氯霉素、氟苯尼考、呋喃唑酮、恩诺沙星、氧氟沙星、土霉素、红霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、氨苄青霉素和四环素的分离，速度快。
说明书
一种快速高效同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法
技术领域
本发明属于环境污染物的检测技术领域，具体涉及一种快速高效检测土壤、污泥中氯霉素、氟苯尼考、呋喃唑酮、恩诺沙星、氧氟沙星、土霉素、红霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、氨苄青霉素和四环素11种类抗生素的方法。
背景技术
由于抗生素具有很好的抗菌作用，被广泛的用于人和动物的疾病治疗，尤其在畜牧业与水产养殖业的使用量非常大，这使得在国内外的环境基质和食品中均检测到了不同浓度的抗生素。环境中抗生素含量不仅严重扰动了土壤微生物基因库，影响生态系统安全，还能通过食物链的传递富集进入到高级动物体内，危害人和动物的健康。
建立快速、准确、同时测定土壤和污泥等固相基质中多种抗生素是研究和控制抗生素生态风险的基础。截止目前，抗生素的检测方法主要包括微生物检测法，免疫分析法，理化检测法三大类。其中，理化检测法检出限最低，是目前应用最广泛的抗生素检测方法。然而，土壤和污泥中抗生素及代谢产物种类繁多且浓度低，而土壤和污泥本身的各种有机或无机杂质都会干扰抗生素的检测。因此，如何有效除杂、快速定性定量成为检测抗生素的重点。
UPLC/MS/MS检测技术通过测质荷比丰度从而得到离子流色谱图，专属性较强，所以干扰较少，定性准确。液质联用灵敏度高，检测限低且分析时间短，适于检测痕量抗生素，能够快速高效同时检测多种抗生素，在土壤和污泥中抗生素检测方面具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目在于提供一种能够同时地检测土壤中多种抗生素的方法，能够快速高效的检测土壤中多种类抗生素，其检测限低，灵敏度高且检测速度快。
技术方案
(1)土壤、污泥样品的采集、保存与前期处理
采集0~20cm表层土壤在-20℃条件下避光保存。对于底泥，采集保存时注意赶出空气，使用冷冻干燥机冷干，研磨过40目筛子，-20℃冷藏。
(2)配制土壤、污泥抗生素提取液
称取含有两个结晶水的磷酸二氢钠3.12 g，加入200 μL浓磷酸，用超纯水定容至100ml，得到pH=3的磷酸缓冲溶液。将色谱级乙腈与磷酸缓冲溶液按照体积比7：3混合，得到土壤提取液。
(3)提取土壤、污泥中抗生素
称取土壤或污泥样品1 g(精确到0.0001g)于50 ml离心管中，依次加入0.2 g Na2EDTA和10 mL土壤、污泥抗生素提取液(见(1))。涡旋1分钟，超声10分钟，离心(8000转)15分钟，收集上清液。此过程共重复3次。将得到的上清液合并后，用超纯水稀释至400 ml。使用0.45μm有机相微孔滤膜抽滤。
(4)固相萃取富集并浓缩抗生素
使用SAX和HLB小柱进行固相萃取：将SAX柱和HLB柱通过SPE连接柱小件连接起来置于固相萃取真空装置上。依次使用6 ml色谱级甲醇和6 mL超纯水对小柱进行活化和冲洗。随后，使用大容量采样管将抗生素提取液(见(2))与固相萃取柱连接，打开真空泵进行固相萃取。结束后，用超纯水清洗固相萃取小柱，真空干燥30分钟。弃去SAX小柱。使用2×5 mL色谱级甲醇将抗生素从HLB小柱中洗脱于15 mL试管中，50℃水浴条件下高纯氮气吹至近干。添加1 mL色谱级甲醇再次溶解抗生素后，使用0.22 μm针式滤膜转移至2 mL进样小瓶中，上机测定。
(5)UPLC/MS/MS检测
将待测提取液通过UPLC/MS/MS(沃特世科技(上海)有限公司)进行分析检测，测定的色谱条件为：采用BEH-C18色谱柱，2.1×100 mm，二元梯度泵(沃特世科技(上海)有限公司);MS/MS检测器(沃特世科技(上海)有限公司);流动相A为0.5%的甲酸，流动相B为乙腈;进样体积10 μL;流速0.4 mL/min;柱温50℃;梯度洗脱顺序：0~1.5 min，90%~84% A;1.5~2 min，84%~82% A;2~2.5 min，82%~80% A;2.5~3 min，80%~78% A;3~4 min，78%~65% A;4~4.5min，65%~40% A;4.5~5 min，40% A;5~6.5 min，40%~5% A;6.5~7 min，5%~90% A;7~10 min，90% A。
质谱条件为：氯霉素采用负离子模式，锥孔电压34 V，碰撞电压16 V，定性判定母离子质荷比为321.00，子离子质荷比为151.97;氟苯尼考采用负离子模式，锥孔电压16 V，碰撞电压18/8 V，定性判定母离子质荷比为356.03，子离子质荷比为185.05/336.00;呋喃唑酮采用正离子模式，锥孔电压46 V，碰撞电压20/22 V，定性判定母离子质荷比为226.07，子离子质荷比为67.08/122.06;恩诺沙星采用正离子模式，锥孔电压10 V，碰撞电压24 V，定性判定母离子质荷比为360.2603，子离子质荷比为342.2815; 氧氟沙星采用正离子模式，锥孔电压为12 V，碰撞电压为30 V，定性判定母离子质荷比为362.2395，定性判定子离子质荷比为261.2175/318.2567;土霉素采用正离子模式，锥孔电压为10 V，碰撞电压为26V，定性判定母离子质荷比为461.2439，定性判定子离子质荷比为426.2635;红霉素采用正离子模式，锥孔电压为6 V，碰撞电压为34/34 V，定性判定母离子质荷比为734.4931，定性判定子离子质荷比为158.1931/576.5374;磺胺嘧啶采用正离子模式，锥孔电压为6 V，碰撞电压为24 V，定性判定母离子质荷比为251.1482，定性判定子离子质荷比为156.0689;磺胺甲恶唑采用正离子模式，锥孔电压为4 V，碰撞电压为24 V，定性判定母离子质荷比为254.148，定性判定子离子质荷比为156.0694;氨苄青霉素采用正离子模式，锥孔电压为32V，碰撞电压为16/16 V，定性判定母离子质荷比为350.08，定性判定子离子质荷比为106.1/174.06;四环素采用正离子模式，锥孔电压为4 V，碰撞电压为24/22 V，定性判定母离子质荷比为445.249，定性判定子离子质荷比为154.1075/410.1938。
(6)计算分离出的抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出抗生素含量。
(7)方法回收率、检测限和定量限
采用加标回收法检测方法的回收率：把空白土壤处理成含有50 μg/L标准抗生素的土壤，用上述方法检测抗生素的含量，从而计算本方法的回收率。以3倍信噪比确定检测限，以10倍信噪比确定定量限，结果如表1所示。
表1一种快速高效同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法的回收率、检测限和定量限
本发明的优点和有益效果
(1)该技术对于提取液的选择是比对文献资料报道的多种提取液，优化提取液种类与比例，使对多种类的抗生素提取效果达到最好，并且配制简单，把Na2EDTA直接加入土壤中，省去了Na2EDTA溶解难的问题，操作步骤简单。
(2)该技术采用UPLC/MS/MS检测技术使用，其高信噪比，高灵敏度，适于检测样品中低含量的抗生素。
(3)UPLC/MS/MS检测技术与HPLC/MS/MS相比运行压力高，分离时间短，10分钟所检测抗生素全部出峰，快速高效。与其他其他技术相比而言，检测限低，灵敏度高，能够同时检测多种抗生素，为探究抗生素在土壤中吸附解吸规律，迁移转化以及降解规律提供了非常便利的途径。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，但本实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1
(1)采集于桥水库前置库底泥土样，保存时赶出空气，放入冰袋冷藏保存，使用冷冻干燥机冷干，研磨过40目筛子，-20 ℃冷藏。
(2)配制土壤、污泥抗生素提取液
称取含有两个结晶水的磷酸二氢钠3.12 g，加入200 μL浓磷酸，用超纯水定容至100ml，得到pH=3的磷酸缓冲溶液。将色谱级乙腈与磷酸缓冲溶液按照体积比7：3混合，得到土壤提取液。
(3)提取土壤、污泥中抗生素
称取污泥样品1 g(精确到0.0001 g)于50 ml离心管中，依次加入0.2 g Na2EDTA和10ml土壤、污泥抗生素提取液(见(1))。涡旋1分钟，超声10分钟，离心(8000转)15分钟，收集上清液。此过程共重复3次。将得到的上清液合并后，用超纯水稀释至400 ml。使用0.45 μm有机相微孔滤膜抽滤。
(4)固相萃取富集并浓缩抗生素
使用SAX和HLB小柱进行固相微萃取：将SAX柱和HLB柱通过SPE连接柱小件连接起来置于固相萃取真空装置上。依次使用6 ml色谱级甲醇和6 mL超纯水对小柱进行活化和冲洗。随后，使用大容量采样管将抗生素提取液(见(2))与固相萃取柱连接，打开真空泵进行固相萃取。结束后，用超纯水清洗固相萃取小柱，真空干燥30分钟。弃去SAX小柱。使用2×5 mL色谱级甲醇将抗生素从HLB小柱中洗脱于15 mL试管中，50℃水浴条件下高纯氮气吹至近干。添加1 mL色谱级甲醇再次溶解抗生素后，使用0.22 μm针式滤膜转移至2 mL进样小瓶中，上机测定。
(5)UPLC/MS/MS检测
将待测提取液通过UPLC/MS/MS(沃特世科技(上海)有限公司)进行分析检测，测定的色谱条件为：采用BEH-C18色谱柱，2.1×100 mm，二元梯度泵(沃特世科技(上海)有限公司);MS/MS检测器(沃特世科技(上海)有限公司);流动相A为0.5%的甲酸，流动相B为乙腈;进样体积10 μL;流速0.4 mL/min;柱温50℃;梯度洗脱顺序：0~1.5 min，90%~84% A;1.5~2 min，84%~82% A;2~2.5 min，82%~80% A;2.5~3 min，80%~78% A;3~4 min，78%~65% A;4~4.5min，65%~40% A;4.5~5 min，40% A;5~6.5 min，40%~5% A;6.5~7 min，5%~90% A;7~10 min，90% A。
质谱条件为：氯霉素采用负离子模式，锥孔电压34 V，碰撞电压16 V，定性判定母离子质荷比为321.00，子离子质荷比为151.97;氟苯尼考采用负离子模式，锥孔电压16 V，碰撞电压18/8 V，定性判定母离子质荷比为356.03，子离子质荷比为185.05/336.00;呋喃唑酮采用正离子模式，锥孔电压46 V，碰撞电压20/22 V，定性判定母离子质荷比为226.07，子离子质荷比为67.08/122.06;恩诺沙星采用正离子模式，锥孔电压10 V，碰撞电压24 V，定性判定母离子质荷比为360.2603，子离子质荷比为342.2815; 氧氟沙星采用正离子模式，锥孔电压为12 V，碰撞电压为30 V，定性判定母离子质荷比为362.2395，定性判定子离子质荷比为261.2175/318.2567;土霉素采用正离子模式，锥孔电压为10 V，碰撞电压为26V，定性判定母离子质荷比为461.2439，定性判定子离子质荷比为426.2635;红霉素采用正离子模式，锥孔电压为6 V，碰撞电压为34/34 V，定性判定母离子质荷比为734.4931，定性判定子离子质荷比为158.1931/576.5374;磺胺嘧啶采用正离子模式，锥孔电压为6 V，碰撞电压为24 V，定性判定母离子质荷比为251.1482，定性判定子离子质荷比为156.0689;磺胺甲恶唑采用正离子模式，锥孔电压为4 V，碰撞电压为24 V，定性判定母离子质荷比为254.148，定性判定子离子质荷比为156.0694;氨苄青霉素采用正离子模式，锥孔电压为32V，碰撞电压为16/16 V，定性判定母离子质荷比为350.08，定性判定子离子质荷比为106.1/174.06;四环素采用正离子模式，锥孔电压为4 V，碰撞电压为24/22 V，定性判定母离子质荷比为445.249，定性判定子离子质荷比为154.1075/410.1938。
(6)计算分离出的抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出抗生素含量。