申请日2016.11.21
公开(公告)日2017.05.31
IPC分类号C12N1/20; C12Q1/68; C12R1/38
摘要
本发明涉及一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法：以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株;并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌;对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。通过进行假单胞菌在不同单一碳源培养基中的培养测试，以及菌浓度的测量与比较，可以判定OD600值较高的实验组所对应的碳源可以被假单胞菌高效利用，即为其最适单一碳源。通过本发明的方法，可获取活性污泥中合成PHA假单胞菌的碳源利用偏好、利用效率、代谢能力等相关信息，再通过菌种强化，可为深入研究PHA产量提升提供基础。
权利要求书
1.一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法，其特征是：以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株;并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌;对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤如下：
(1)取活性污泥样品，接种于筛选培养基中，培养36h后，取菌液稀释至10-4-10-6倍并涂布在固体培养基上，将长出的单菌落进行尼罗蓝染色，并挑选出能被尼罗蓝染色的单菌落;对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。
(2)利用细菌基因组提取试剂盒提取筛选得到的细菌的基因组，然后对基因组16SrDNA进行扩增，将得到的PCR产物测序，根据测序结果以及GenBank数据库对比分析，确定菌株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是筛选培养基为：蛋白胨10，牛肉膏5，葡萄糖5，硫酸铵0.5，硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.1，pH调整为7;采用蒸馏水配置，并在灭菌锅中115℃灭菌30min，其中葡萄糖单独灭菌，两部分分别灭菌后，再于无菌条件下混合。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的碳源利用测试过程包括分别选取葡萄糖、木糖、乙酸钠、蔗糖、乳酸钠和柠檬酸的常见碳源作为单碳源，将假单胞菌在不同单一碳源培养基上培养，通过比较接种后假单胞菌生物生长情况判定最优单一碳源。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是葡萄糖培养基：葡萄糖1g，酵母提取物0.05g以及铵盐、镁离子组、磷源组和微量金属离子组各1mL;葡萄糖和酵母提取物于灭菌锅中115℃灭菌30min，再于无菌条件下，加入其他成分。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是以200ml计：铵盐和镁离子组为10g硫酸铵，2g无水硫酸镁，用蒸馏水定容至200mL，121℃灭菌20min。
7.如权利要求5所述的方法，其特征是以200ml计：磷源组：96.5g十二水磷酸氢二钠，15g磷酸氢二钾，用蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌20min。
8.如权利要求5所述的方法，其特征是以200ml计：微量金属离子组的具体组成：50g/L柠檬酸铁铵溶液10ml，29.8g/L六水氯化钙10ml，412mol/L浓盐.17mL酸，1mg七水硫酸锌，0.3mg四水氯化锰，3mg硼酸，2mg六水氯化钴，0.064mg硫酸铜，0.2mg氯化镍，0.3mg二水钼酸钠，用蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌20min。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是菌种强化过程是在单碳源的基础上，添加1g/L的酵母提取物，观察假单胞菌的生长变化。
说明书
一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法
技术领域
本发明涉及一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法。
技术背景
聚羟基烷酸酯(PHA)由于其良好的生物相容性、环境友好性、原料可再生性等特点，可作为传统塑料的优良替代品而受到广泛关注[1]，且在生物医药领域也有广泛应用。从2011年至2020年，全球对PHA的需求量将从3万吨增长至12万吨以上[2,3]。从1926年PHB的发现，到现在已经过去整整80年了。在这80年里，文献报导了超过300种PHA生产菌，其中较为常见的有：重组大肠杆菌[4](Recombinant E.coli)，假单胞菌[5](Pseudomonassp.)，产碱杆菌[6](Alcaligenes eutrophus)，博克霍尔德式菌[7](Burkholderiacepacia)以及巨大芽孢杆菌[8](Bacillus sp.)等。
其中假单胞菌(Pseudomonas.sp)属于假单胞菌属，是一种革兰氏阴性菌，无核，严格好氧，假单胞菌在自然界中分布非常广泛，在土壤，水体，以及各种植物中均有分布。常见的几种假单胞菌，有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)以及荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等。常用于MCL-PHAs的生产，在加入C4～C6的糖类或者脂肪酸盐作为底物时，其胞内会积累大量的P(3HB-co-3HHx)以及P(3HB-co-3HD)等PHA共聚体，同时随着底物碳原子数量的不同，其积累的PHA共聚体的组成也不尽相同[9]。
假单胞菌能利用的碳源很多，并且很多碳源都能用于PHA生产。Ward等人[10]利用苯乙烯、苯乙酸以及葡萄糖等作为底物，最终PHA的积累量达到了0.22g PHA/g Carbon。He等人[11]利用葡萄糖和大豆油作为底物，最终PHA积累量分别为52%和63%。另外，诸如木糖、果糖等常见碳源，也有文献报导其在假单胞菌积累PHA方面的应用。由于假单胞菌积累PHA的能力，其在微生物发酵生产PHA的研究中具有良好的开发前景，那么，对野生假单胞菌产PHA相关内容的初步研究以指导菌株的进一步优化就很有意义。
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[2]Lara D,Michael C,Achim R,et al.Market developments of andopportunities for biobased products and chemicals.Nova-Institute for Ecologyand Innovation Reprot,2013,52202
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[4]Lee S Y.Poly(3-Hydroxybutyrate)Production from Xylose byRecombinant Escherichia Coli.bioprocess engineering,1998,18(5):397-399
[5]Young F K,Kastner J R.,May S W.Microbial Production of Poly-Β-Hydroxybutyric Acid from D-Xylose and Lactose by Pseudomonas Cepacia.ApplEnviron Microbiol,1994,11:4195-4198
[6]Linko S,Vaheri H,J.Production of Poly-Β-Hydroxybutyrate byAlcaligenes Eutrophus on Different Carbon Sources.Appl Microbiol Biotechnol,1993,39(1):11-15
[7]Keenan T M,Tanenbaum S W,Stipanovic A J,et al.Production andCharacterization of Poly-Β-Hydroxyalkanoate Copolymers from BurkholderiaCepacia Utilizing Xylose and Levulinic Acid.Biotechnology Progress,2004,20(6):1697–1704
[8]Lemoigne M.Products of Dehydration and of Polymerization ofΒ-Hydroxybutyric Acid.Bull.Soc.Chem.Biol,1926,8:770-782
[9]Tripathi L,Wu L P,Dechuan M,et al.Pseudomonas Putida Kt2442 as aPlatform for the Biosynthesis of Polyhydroxyalkanoates with AdjustableMonomer Contents and Compositions.Bioresour Technol,2013,142:225-231
[10]Ward P G,Roo G D,O'Connor K E.Accumulation ofPolyhydroxyalkanoate from Styrene and Phenylacetic Acid by Pseudomonas PutidaCa-3.Appl Environ Microbiol,2005,71(4):2046-2052
[11]He W,Tian W,Zhang G,et al.Production of NovelPolyhydroxyalkanoates by Pseudomonas Stutzeri 1317 from Glucose and SoybeanOil.FEMS Microbiol Lett,1998,169(1):45-49
发明内容
鉴于上述，本发明提出一种用于合成PHA野生假单胞菌初步研究的方法，即积累PHA所需最优单一碳源的判定以及菌种初步强化方法。
本发明的技术方案如下：
一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法：以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株;并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌;对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。
具体步骤如下：
(1)取活性污泥样品，接种于筛选培养基中，培养36h后，取菌液稀释至10-4-10-6倍并涂布在固体培养基上，将长出的单菌落进行尼罗蓝染色，并挑选出能被尼罗蓝染色的单菌落;对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。
(2)利用细菌基因组提取试剂盒提取筛选得到的细菌的基因组，然后对基因组16SrDNA进行扩增，将得到的PCR产物测序，根据测序结果以及GenBank数据库对比分析，确定菌株类型。
所述的筛选培养基为：蛋白胨10，牛肉膏5，葡萄糖5，硫酸铵0.5，硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.1，pH调整为7;采用蒸馏水配置，并在灭菌锅中115℃灭菌30min，其中葡萄糖单独灭菌，两部分分别灭菌后，再于无菌条件下混合。
所述的碳源利用测试过程包括分别选取葡萄糖、木糖、乙酸钠、蔗糖、乳酸钠和柠檬酸的常见碳源作为单碳源，将假单胞菌在不同单一碳源培养基上培养，通过比较接种后假单胞菌生物生长情况判定最优单一碳源。
所述葡萄糖培养基：葡萄糖1g，酵母提取物0.05g以及铵盐、镁离子组、磷源组和微量金属离子组各1mL;葡萄糖和酵母提取物于灭菌锅中115℃灭菌30min，再于无菌条件下，加入其他成分。
以200ml计：铵盐和镁离子组为10g硫酸铵，2g无水硫酸镁，用蒸馏水定容至200mL，121℃灭菌20min。
以200ml计：磷源组：96.5g十二水磷酸氢二钠，15g磷酸氢二钾，用蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌20min。
以200ml计：微量金属离子组的具体组成：50g/L柠檬酸铁铵溶液10ml，29.8g/L六水氯化钙10ml，412mol/L浓盐.17mL酸，1mg七水硫酸锌，0.3mg四水氯化锰，3mg硼酸，2mg六水氯化钴，0.064mg硫酸铜，0.2mg氯化镍，0.3mg二水钼酸钠，用蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌20min。
菌种强化过程是在单碳源的基础上，添加1g/L的酵母提取物，观察假单胞菌的生长变化。
补充说明如下：
蔗糖培养基：包含1g蔗糖，不含其它碳源，其余成分与配制方法同葡萄糖培养基。
柠檬酸培养基：包含1g柠檬酸，不含其它碳源，其余成分与配制方法同葡萄糖培养基。
乙酸钠培养基：包含1g乙酸钠，不含其它碳源，其余成分与配制方法同葡萄糖培养基。
乳酸钠培养基：包含1g乳酸钠，不含其它碳源，其余成分与配制方法同葡萄糖培养基。
木糖培养基：包含1g木糖，不含其它碳源，其余成分与配制方法同葡萄糖培养基。
具体方法是首先配置上述的液体培养基，各培养基中碳源初始浓度为10g/L，分别取100ml置于无菌的250ml锥形瓶中，然后将假单胞菌接种在各培养基中进行摇床培养，初始接种量OD600值为0.1，培养开始后48h分别取样在波长为600nm的紫外下测定样品菌液的吸光度，从而推断菌液浓度，每组实验均做三个平行，取结果平均值。
菌体浓度的测定主要利用光密度法，具体操作步骤如下：取相应的培养基做为空白对照，在波长为600nm的紫外下测定样品菌液的吸光度(OD600)。如果样品的OD600值过大，则对样品进行适当的稀释，使最终测量的结果保持在0.2-0.8之间，以保持精确度。
通过进行假单胞菌在不同单一碳源培养基中的培养测试，以及菌浓度的测量与比较，可以判定OD600值较高的实验组所对应的碳源可以被假单胞菌高效利用，即为其最适单一碳源。
所述的菌种强化方法是通过在上述的不同单一培养基中加入1g/L酵母提取物，然后用其对假单胞菌进行培养，同样测定培养开始后48h的OD600，与未加酵母提取物的培养测试结果进行比较，比较假单胞菌生长情况的变化，来考察菌种的强化。通过比较结果可以知道，
以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株;并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定的方法，鉴定并获取其中的假单胞菌;对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌株的初步强化。
本发明的特点是：
本发明为一种用于活性污泥中产PHA假单胞菌初步研究的方法，具体包括以富含混合菌群的活性污泥为原料，在筛选培养基上培养并结合尼罗蓝染色法筛选出PHA合成菌株;并通过菌种分离纯化以及菌种鉴定等手段，鉴定并获取其中的假单胞菌;对获取的假单胞菌进行碳源利用测试以及菌种的初步强化。通过本发明的方法，可获取活性污泥中合成PHA假单胞菌的碳源利用偏好、利用效率、代谢能力等相关信息，再通过菌种强化，可为深入研究PHA产量提升提供基础。