新精神活性物质(new psychoactive substances, NPS)是指为了逃避法律对传统毒品的管制或提高毒品的药理活性, 对已有毒品的化学结构加以修饰, 制成的具有类似列管毒品麻醉、兴奋或致幻作用的药.与传统毒品相比, NPS种类更为繁多、更新速度更快.截至2015年底, 已发现NPS的种类从2009年的166种增长到了2015年的644种, 远远超过国际管制的常规违禁药物总数(234种).目前发现的NPS主要包括以下七类：合成卡西酮类、哌嗪类、苯乙胺类、合成大麻素类、植物源类物质(如卡痛叶和鼠尾草等)、氯胺酮和其他物质(包括氨基茚满、色胺和苯环己哌啶型物质等).随着NPS滥用的增多以及其危害性逐渐被认识, 部分NPS开始被一些国家列为管制药物.我国也已将部分卡西酮类和哌嗪类物质列入管制药品.
与人们服用的常规药物类似, NPS被滥用后, 经人体新陈代谢所生成的代谢产物和未被代谢的原药随尿液进入生活污水, 从而汇入污水处理厂.经污水厂处理后, 未被去除的NPS被排入自然水体.因此, 污水处理厂排放被认为是环境中NPS的主要来源之一. NPS具有较强的生物活性, 其大量被排入到环境中, 不仅对环境造成了污染, 而且带来了潜在的健康风险.因此, NPS也被环境学家列为一类新型污染物.
基于NPS带来的社会问题和环境问题, 对其进行定性定量分析并估算其滥用量对于毒品管控和健康风险评价具有重要意义.然而, 传统方法如社会调查不能准确、客观地估算NPS的滥用量, 且操作成本较高、不确定性较大.近年来, 一种叫污水流行病学的方法(wastewater-based epidemiology)被提出并用于估算毒品的滥用量.其原理是通过测定污水处理厂进水中毒品及其代谢物浓度, 通过污水厂日处理量、服务区人口及毒品排泄率等参数反算毒品滥用量.该方法所得数据更为客观, 具有时效性高、便于不同区域横向比较等优点, 且已在估算传统毒品滥用量等方面发挥了巨大作用.近年来, 已有研究团队应用该方法分析测定了污水中卡西酮类和哌嗪类NPS, 认为该方法具有预警NPS滥用的潜能, 并可用于评价禁毒措施的绩效性.但污水中其它常见NPS[如4-甲氧基甲基苯丙胺、2-甲基氨基-1-(3, 4-亚甲二氧苯基)-1-丙酮、2, 5-二甲氧基-4-苯乙胺等]的分析方法仍不完善.
为进一步完善污水中常见NPS的分析方法并提高分析测定效率, 经调查, 本研究选取国内滥用较多的11种NPS作为目标化合物, 建立污水中目标物前处理及分析测定方法, 并通过对北京市主城区11家污水处理厂进、出水样品的分析进行方法验证, 以期为今后开展NPS的污水流行病学研究及健康风险评价奠定基础.
1 材料与方法1.1 材料
11种NPS标准品(100 μg·mL-1于甲醇, 纯度>99%)以及各自相应的氘代内标储备液(10 μg·mL-1于甲醇, 纯度>99%)购于美国Cerilliant公司, 包括氯胺酮(KET)、甲卡西酮(MC)、麻黄碱(EPH)、4-甲氧基甲基苯丙胺(PMMA)、2-甲基氨基-1-(3, 4-亚甲二氧苯基)-1-丙酮(MDMC)、2, 5-二甲氧基-4-苯乙胺(2C-I)、甲氧麻黄酮(MEPH)、卡西酮(CA)、1-苄基哌嗪(BZP)、1-(3-三氟甲基苯基)哌嗪(TFMPP)和1-(3-氯苯基)哌嗪(mCPP), 以及KET-D4、MC-D3、EPH-D3、MEPH-D3、MDMC-D3、2C-I-13C-D3、CA-D5、BZP-D7、TFMPP-D4和mCPP-D8.
主要仪器和耗材：12位固相萃取装置(德国CNW公司), Oasis MCX和Oasis HLB固相萃取柱(均为60 mg 3 mL, 美国Waters公司), 超高效液相色谱-串联质谱联用仪(色谱仪：日本岛津UFLCXR-LC, 质谱仪：美国AB Sciex API-4000)等.
1.2 质谱和液相色谱条件的优化
根据目标物的性质选择离子源和离子化模式.根据目标物及其氘代化合物的分子量设置扫描的荷质比m/z范围, 寻找目标物母离子.利用仪器自动优化去簇电压(DP)得到最大母离子响应.手动调节和优化碰撞能量(CE), 得到最佳响应的子离子对.将每种目标物丰度最大的离子对作为定量离子, 另一离子对作为定性离子.
采用液相色谱柱Phenomenex Gemini C18柱(100 mm×2 mm, 3 μm), 优化流动相pH值和所含盐类、洗脱梯度等条件, 以获得目标物的理想峰型和高分离度.
1.3 样品前处理方法
采用固相萃取的方法对污水样品进行浓缩和净化, 使用Oasis MCX作为SPE柱的样品前处理方法如图 1.使用Oasis HLB作为SPE柱的样品前处理方法与上述基本相同, 不同之处在于②Oasis HLB柱活化：依次加入6 mL甲醇和6 mL超纯水, 流速1~2 mL·min-1; ⑦洗脱：用8 mL甲醇洗脱干燥的HLB柱, 流速1~2 mL·min-1.
图 1
1.4 质量控制1.4.1 回收率
分别取20、100和200 μL的200 ng·mL-1混标注入50 mL pH=2的超纯水中配成样品溶液, 并设置一组流程空白, 同时进行前处理和测定.根据流程空白和加标样品的测定数据及实际加标浓度计算得到11种NPS在不同浓度梯度下各自的回收率.
1.4.2 基质效应
选取BJ-6污水厂进水水样作为基质效应的供试水样.对该水样进行前处理, 在上机前分别向已处理的样品中加入20、100和200 μL的200 ng·mL-1混标和100 μL的200 ng·mL-1内标, 得到浓度为10、50和100 ng·mL-1的样品和空白样品(仅加入内标).通过比较各目标物在不同浓度梯度下加标水样与空白水样的检测浓度之差和其在相应浓度标准样品中的检测浓度, 评价基质对各目标物响应值的抑制和促进作用.
1.4.3 检出限和定量限
将低浓度目标物混合标准溶液上机测定, 仪器检出限(ILOD)和仪器定量限(ILOQ)分别以3倍信噪比(3S/N)和10倍信噪比(10S/N)确定.方法检出限(MLOD)和方法定量限(MLOQ)分别通过以下公式计算得到
式中, 400 μL为上机浓缩液的体积, 50 mL为前处理所取污水样的体积.
1.4.4 标准曲线的线性及范围
配制含甲醇体积20%、浓度范围为0.1~200 ng·mL-1的不同浓度梯度的标准工作溶液, 尽可能保证浓度范围覆盖实际污水样品中的水平.
1.4.5 精密度
分别对同一标准样品连续多次测定(n=3)和多天重复测定(n=3)来衡量仪器的日内精密度与日间精密度, 对同一水样连续前处理(n=3)和多天重复前处理(n=3)来衡量前处理方法和实验操作的日内精密度与日间精密度, 结果均用相对标准偏差(RSD)表示.
2 结果与讨论2.1 优化后的液相色谱条件
本研究采用Phenomenex Gemini C18(100 mm×2 mm, 3 μm)液相色谱柱对目标化合物进行分离.优化后的流动相为：0.12%甲酸30 mmol·L-1, 甲酸铵超纯水溶液(A相); 甲醇(B相).洗脱梯度如表 1所示, 流速为0.3 mL·min-1, 柱温为35℃, 进样量为5 μL.优化后的液相色谱条件不仅提高了仪器对目标化合物的灵敏度, 而且明显缩短了分析周期, 提高了分析效率.
2.2 优化后的质谱条件
本研究采用多反应监控模式(MRM)对所有目标化合物进行检测.离子源为电喷雾离子源(ESI), 离子源电压(IS)为3 500 V, 离子源温度(TEM)为525℃, 离子化模式为ESI(+); 碰撞池气压(CAD)为10 psi(69 kPa), 气帘气压力(CUR)为20 psi(138 kPa), 干燥气(GS1)与辅助气(GS2)压力均为40 psi(276 kPa).每种目标化合物及其相应内标的母离子和定量、定性离子的核质比(m/z)、去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)及保留时间(RT)等质谱参数列于表 2中.
表 2 目标物C18-UPLC-MS/MS的质谱参数
图 2为优化后11种NPS的色谱图.由表 2和图 2可知, 不同目标化合物的保留时间均有较大差异, 说明优化后的C18-UPLC-MS/MS条件能够对所选目标物进行有效分离.
图 2
2.3 优化后的样品前处理条件2.3.1 SPE柱和样品pH值
Oasis HLB和Oasis MCX是环境水样前处理中广泛使用的两种SPE柱.本研究分别考察两种SPE柱在不同pH条件下加载样品对目标NPS回收率的影响. Oasis HLB柱的加载条件为pH=2, 7, 11; Oasis MCX柱的加载条件为pH=2, 7.按1.3节中所述方法进行前处理.
由表 3可知, HLB柱在酸性、中性和弱碱性条件下均无法对CA进行富集. MC、PMMA、2C-I和MEPH的回收率在样品pH值为2、7、11时存在显著差异, 且回收率存在低于80%和高于120%的情况.可见, 使用Oasis HLB柱对样品进行富集时, 样品pH值对目标物的回收率有显著影响, 且不同NPS的最佳pH值存在较大差异.因此Oasis HLB柱不适宜用于测定污水中常见NPS的前处理过程.而使用Oasis MCX柱时, 在样品pH值为2和7的条件下, 每种NPS均被有效富集, 且目标物的回收率基本在80%~120%之间, 因此Oasis MCX柱更适合用于水样的前处理.综合比较使用Oasis MCX柱时的两种样品pH值条件, pH=2时各种物质的回收率更接近于100%, 因此本研究认为在pH值为2的条件下使用Oasis MCX柱更适合于含多种NPS水样的前处理与同步测定.在后续实验及今后实际污水样品前处理时, 统一选用Oasis MCX柱并将样品pH值调至2.具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
表 3 不同SPE柱和水样pH值条件下目标物的回收率比较/%
本研究对于SPE柱选择的实验结果与文献[23~25]的研究结论具有一致性, 即对于CA、MC、MEPH等NPS在内的毒品, 用Oasis HLB柱前处理的回收率和基质效应均差于Oasis MCX柱或不能达到实验要求.这可能是由于Oasis MCX柱的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物, 与Oasis HLB吸附剂相比, 对碱性化合物具有更高的选择性和灵敏度.而本研究所监测的NPS均具有含氮的碱性基团, 因此Oasis MCX柱能够更有效满足富集要求.
2.3.2 淋洗步骤
当目标物及其内标受基质干扰严重或者基质对两者的影响程度不一致时, 为保证目标物准确定量, 有必要在污水样品加载之后增加对SPE柱的淋洗步骤.本研究在Oasis MCX固相萃取方法的基础上, 在样品加载结束之后, 将淋洗步骤分别改为无淋洗、2 mL pH=2的超纯水淋洗和2 mL甲醇淋洗这3组对照实验, 研究淋洗步骤对目标物回收率的影响.
表 4中的数据显示, 无淋洗和仅用2 mL pH=2的超纯水淋洗时, KET和MEPH的回收率降至80%以下, CA的回收率降至不足50%;而仅用2 mL甲醇淋洗时2C-I的回收率降至了80%以下, CA的回收率降至不足55%.这表明样品加载后先用2 mL pH=2的超纯水、再用2 mL甲醇淋洗的两个步骤均不可或缺.
表 4 不同淋洗和复溶条件下目标物的回收率比较/%
2.3.3 复溶溶剂的量与复溶步骤
为研究复溶条件的改变对目标物回收率的影响, 本研究设置两组对照实验, 分别为：①200 μL 20%甲醇水溶液复溶氮吹残留物1 min, ②先用80 μL甲醇复溶30 s, 再加入320 μL超纯水复溶30 s.
由表 4中不同复溶条件下的回收率数据可知, 改变复溶溶剂的量和步骤后, PMMA的回收率均超过120%, 远超可接受范围.因此本研究认为, 在现有的固相萃取和C18-UPLC-MS/MS条件下, 采用400 μL 20%甲醇水溶液复溶氮吹残留物1 min最为合适.
2.4 对已优化方法的评价2.4.1 回收率和基质效应
如表 5所示, 在基本覆盖了实际污水中NPS检出浓度的各种条件下, 每种目标物的回收率基本上均在80%~120%之间, 基质效应基本上均在-20%~20%之间.结果总体表明, 本研究采用上述方法进行前处理和样品测定是可行的.
表 5 SPE-C18-UPLC-MS/MS优化方法的回收率和基质效应/%
2.4.2 检出限、定量限、标准曲线线性及范围
表 6中的结果显示, 各种目标物的LOD和LOQ均很低, 基本满足实际污水样品测定的要求.所有目标物的标准曲线相关系数均在0.99以上, 且基本所有浓度梯度下的准确度均在85%~115%之间、RSD < 15%, 因此标准曲线可以用于实际污水中NPS浓度的测定.
表 6 SPE-C18-UPLC-MS/MS优化方法的检出限、定量限、标准曲线线性及范围
2.4.3 精密度
由表 7可知, 仪器精密度的日内和日间RSD均小于2.5%, 方法精密度的日内和日间RSD均小于8%, 表明仪器的稳定性和实验方法的可重复性均符合要求.综上, 应用本研究中优化的SPE前处理方法和C18-UPLC-MS/MS测定方法可以用于污水样品中的多种NPS同步分析.
表 7 仪器精密度和SPE-C18-UPLC-MS/MS优化方法的精密度/%
3 在实际污水样品中的应用
本研究于2016年12月对北京市11家污水处理厂的进水和出水进行了样品采集, 每家污水厂至少采集2 d以上的样品, 采用全自动水质采样器采集24 h混合水样.全部11家污水厂日均污水流量约为26万m3, 服务区总人口达1 096万人, 约占北京市常住人口的50.4%.采用上述优化的方法对样品进行前处理和分析测定, 根据进水和出水中NPS浓度的差别计算各种目标物的去除率.
测定结果显示, MDMC、MEPH、CA、BZP和mCPP在11家污水厂的进水和出水样品中均未被检出, 表明这几种NPS在北京市可能尚无显著滥用趋势.其余6种NPS在各污水厂进水样品中的平均浓度如图 3所示.其中, EPH在进水中的浓度水平最高, 浓度范围在84.23~383.6 ng·L-1; 其次为PMMA, 浓度范围在9.12~38.48 ng·L-1.值得注意的是, 2C-I虽然仅在BJ-4检出, 但其在进水中的浓度高达92 ng·L-1, 说明在该厂服务区内可能存在2C-I的滥用或者倾倒现象.进水中KET、MC和TFMPP的浓度均低于8 ng·L-1.实际污水样品测定结果表明, 本研究中的优化方法能够基本满足污水中的NPS检测要求.
这11家污水处理厂对每种目标物的去除率汇总于表 8中.数据显示, BJ-5、BJ-9和BJ-11中目标物去除率较高, 而其余污水厂对多数目标物的去除率并不理想, 甚至出现了负去除率的情况.造成负去除率的原因可能是污水在污水处理厂中存在长达数小时的停留时间, 因此进、出水中测得的目标物浓度水平无法准确对应.但总体看来, 这一结果仍表明常见的污水处理工艺对NPS的去除能力有限, 有相当数量的NPS将最终进入河流湖海中, 对水环境生态形成潜在的威胁.
表 8 北京市11家污水处理厂对NPS的去除率/%
4 结论
(1) 对污水样品前处理方法进行了优化, 表明应选用Oasis MCX柱, 预先调节样品至pH=2, 样品加载完后先用2 mL pH=2的超纯水淋洗、再用2 mL甲醇淋洗Oasis MCX柱, 抽干后氮吹, 最后用400 μL 20%甲醇水溶液复溶残留物1 min.
(2) 11种NPS的保留时间、回收率、基质效应、检出限、定量限、精密度等方法评价指标数据表明, 本研究所确定的SPE前处理方法和C18-UPLC-MS/MS测定方法分离效果好、回收率高、基质效应弱、检出限和定量限低、仪器和方法精密度高, 可用于实际污水样品中NPS浓度的检测.
(3) 对北京市11家污水厂进、出水样品中NPS浓度的测定结果显示, 优化的前处理和测定方法能够基本满足分析要求. EPH、PMMA和2C-I在进水中的浓度较高.多数目标物在污水厂中的去除率并不理想, NPS随出水进入河流等生态环境, 产生潜在威胁.(来源：环境科学学报 作者：陈培培)