公布日：2023.09.22
申请日：2023.04.17
分类号：C12N1/21(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/53(2006.01)I;C12N15/55(2006.01)I;C12N1/36(2006.01)I;C02F3/34(2023.01)I;C12R1/19(2006.01)N;C02F101
/16(2006.01)N
摘要
本发明涉及污水处理与基因工程技术领域，具体涉及一种用于高氨氮废水的基因工程菌及其构建方法。本发明基因工程菌保藏号为CCTCCNO：M2023301，保藏于中国典型培养物保藏中心。在基因工程菌中加载氨单加氧酶基因与脂肪酶基因，氨单加氧酶是硝化菌代谢过程中的关键酶，主要催化氨氮氧化形成羟胺，脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，能分解生物所产生的各种天然的油和脂肪，可降解污水中COD，氨单加氧酶基因协同脂肪酶基因，表达出氨单加氧酶与脂肪酶，实现高氨氮废水中氨氮以及COD的去除。本发明基因工程菌在高氨氮废水处理中COD去除率为94.02％～96.35％，氨氮去除率为93.62％～94.32％，脱氮、降解效果良好，同时废水处理成本低、效率高、效果稳定、无污染，便于在高氨氮废水处理中应用。
权利要求书
1.一种用于高氨氮废水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌具有如SEQIDNo.5所示的外源氨基酸序列，保藏号为CCTCCNO：M2023301，保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的一种用于高氨氮废水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌中如SEQIDNo.5所示的氨基酸序列由如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨单加氧酶基因)和如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)基因融合获得。
3.根据权利要求2所述的一种用于高氨氮废水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌中表达如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨单加氧酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表达如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
4.根据权利要求1所述的一种用于高氨氮废水的基因工程菌，其特征在于：所述的高氨氮废水包括生活污水、工业废水以及垃圾渗滤液。
5.根据权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得AMO(氨单加氧酶基因)-TLL5(脂肪酶基因)目的基因；2)将目的基因AMO-TLL5导入表达载体PET28a中获得重组表达载体PET28a-AMO-TLL5；3)将重组表达载体PET28a-AMO-TLL5转化到大肠杆菌BL21中，挑阳性克隆到LB培养基中过夜培养得到重组工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5；4)将重组工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5，在高浓度氨氮条件下驯化，得到具有处理高氨氮废水能力的基因工程好氧硝化细菌；5)将该菌株投入到发酵培养基中扩大培养，而后投入污水中使用。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的步骤1)中采用重叠PCR技术将AMO和TLL5融合表达。
7.根据权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的步骤3)中LB培养基中抗生素的添加量为1‰，在37℃、200rpm摇床上培养10～12h。
8.根据权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的步骤4)中高氨氮废水中氨氮的浓度为400～600mg/L，COD浓度为600～650mg/L。
9.根据权利要求8所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的步骤5)中高氨氮废水中COD的去除率为94.02％～96.35％，氨氮的去除率为93.62％～94.32％。
10.根据权利要求5所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的步骤5)中发酵培养基的配方为：每1L水中，硫酸铵1g，氯化钠0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，七水硫酸镁0.03g，三水磷酸氢二钾1.3g，碳酸钙5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种用于高氨氮废水的基因工程菌及其构建方法，以解决天然的硝化细菌培养困难、在高氨氮废水处理过程中硝化反应速率低以及脱氮效果不稳定的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于高氨氮废水的基因工程菌，所述的基因工程菌具有如SEQIDNo.5所示的外源氨基酸序列，保藏号为CCTCCNO：M2023301，保藏于中国典型培养物保藏中心。
进一步地，所述的基因工程菌中如SEQIDNo.5所示的氨基酸序列由如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨单加氧酶基因)和如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)基因融合获得。
进一步地，所述的基因工程菌中表达如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨单加氧酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表达如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
进一步地，所述的高氨氮废水包括生活污水、工业废水以及垃圾渗滤液。
上述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
1)获得AMO(氨单加氧酶基因)-TLL5(脂肪酶基因)目的基因；
2)将目的基因AMO-TLL5导入表达载体PET28a中获得重组表达载体PET28a-AMO-TLL5；
3)将重组表达载体PET28a-AMO-TLL5转化到大肠杆菌BL21中，挑阳性克隆到LB培养基中过夜培养得到重组工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5；
4)将重组工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5，在高浓度氨氮条件下驯化，得到具有处理高氨氮废水能力的基因工程好氧硝化细菌；
5)将该菌株投入到发酵培养基中扩大培养，而后投入污水中使用。
进一步地，所述的步骤1)中采用重叠PCR技术将AMO和TLL5融合表达。
进一步地，所述的步骤3)中LB培养基中抗生素的添加量为1‰，在37℃、200rpm摇床上培养10～12h。
进一步地，所述的步骤4)中高浓度氨氮污水中氨氮的浓度为400～600mg/L，COD浓度为600～650mg/L。
进一步地，所述的步骤5)中高氨氮废水中COD的去除率为94.02％～96.35％，氨氮的去除率为93.62％～94.32％。
进一步地，所述的步骤5)中发酵培养基的配方为：每1L水中，硫酸铵1g，氯化钠0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，七水硫酸镁0.03g，三水磷酸氢二钾1.3g，碳酸钙5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g。
本发明的有益效果：基因工程菌在高氨氮废水处理中COD去除率为94.02％～96.35％，氨氮去除率为93.62％～94.32％，脱氮、降解效果良好，同时废水处理成本低、效率高、效果稳定、无污染，便于在高氨氮废水处理中应用。
（发明人：杜莉莉;蔺洪永;包海花;张涵仪;谢佳）