申请日2019.02.21
公开(公告)日2019.05.28
IPC分类号G01N21/552
摘要
本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面;废水样品加入：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中;细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化;细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。本发明分析单细菌的纳米振动行为。观察加入样品后细菌振动衰减情况，快速监测废水急性毒性信息。相比传统方法，本发明速度快、抗干扰性强。分析结果不易受溶液色度、盐度、硬度的影响，结果准确。
权利要求书
1.一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：
A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面;
B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中;
C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化;
D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面等离子体机械振动成像系统包括：沿光路方向依次设置的光源、光路方向控制系统、高数值孔径物镜、表面等离子体共振传感芯片、样品池、反射镜、分束器、CCD相机;
其中，样品池设置于所述表面等离子体共振传感芯片上;表面等离子体共振传感芯片设置于所述显微镜载物台上;所述光路方向控制系统包括沿光路方向依次设置的透镜、偏振片和低通分束器。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光源为660nm的发光二极管;所述样品池材质为聚二甲基硅氧烷。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表面等离子体共振传感芯片为经磁控溅射在玻璃载玻片上依次镀铬层、镀金层，再经11-巯基-1-十一醇溶液浸泡修饰。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述铬层的厚度为1.5～2nm;金层的厚度为45～47nm;所述11-巯基-1-十一醇溶液的浓度为1mM;所述浸泡时间为10～12h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，光路全内反射入射角为：调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CCD相机采集参数为：采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧，采集频率为106.7Hz，曝光时间为5000μs。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D)所述细菌毒性分析具体为：采用matlab代码提取单个细菌的表面等离子体共振强度信息值，根据消逝波强度在表面随垂直距离增加而指数衰减的特性，计算出细菌的垂直位置变化，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毒理学模型包括Logistic模型。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌为Escherichia coliJM109;
所述细菌培养方法具体为：从细菌培养LB平板中挑取单克隆E.coliJM109菌落，加入LB培养基中，在恒温摇床中35～37℃震荡培养10～12h,离心收取细菌菌体，并用1×磷酸盐缓冲溶液洗涤，最后分散于1×磷酸盐缓冲溶液至细菌OD600值为0.2。
说明书
一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法
技术领域
本发明涉及环境技术领域，尤其是涉及一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子机械振动成像方法。
背景技术
频繁发生的水污染事故严重影响着人们的用水安全，威胁着流域生态环境。而急性毒性作为废水毒理学分析的重要指标，也具有极其重要的实际意义。传统的急性毒性分析方法包括藻类生长抑制法、溞类活动抑制法、种子发芽根伸长毒性实验法等等。然而这些方法需要使用模式动植物，实验耗时较长，并且操作复杂，难以满足人们对于水质毒性的实时在线监测与事故早期预警的需求。
较之模式动植物，微生物生长繁殖速度快，吸收转化效率高，是急性毒性分析的理想测试物种。目前利用细菌的急性毒性分析方法主要有发光细菌法与生物电化学系统法。发光细菌法将明亮发光杆菌或基因工程菌株等特定发光细菌置于测试废水之中，通过细菌发光强度的衰减程度来判断测试废水的毒性强弱。然而这种方法依赖于特定的发光、基因工程菌株，并且易受溶液色度、离子强度的影响，难以推广应用。
生物电化学系统法则利用异化金属还原菌的胞外电子传递行为，来监测生物电化学系统注入废水前后异化金属还原菌生物电流的强度改变。而这种方法同样依赖于特定的异化金属还原菌，并且分析结果易受溶液中氧化还原活性物质的干扰，灵敏度不佳、重复性较差，难以实现准确定量毒性分析。由此可见，目前的微生物急性毒性监测方法难以快速准确监测废水急性毒性，这为技术的改进留下了空间。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，本发明提供的方法快速、准确、灵敏。
本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：
A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面;
B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中;
C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化;
D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
优选的，所述表面等离子体机械振动成像系统包括：沿光路方向依次设置的光源、光路方向控制系统、荧光激发滤光片高数值孔径物镜、表面等离子体共振传感芯片、样品池、反射镜、分束器、CCD相机;
其中，样品池设置于所述表面等离子体共振传感芯片上;表面等离子体共振传感芯片设置于所述荧光激发滤光片高数值孔径物镜上;所述光路方向控制系统包括沿光路方向依次设置的透镜、偏振片和低通分束器。
优选的，所述表面等离子体共振光源为660nm的发光二极管;所述样品池材质为聚二甲基硅氧烷。
优选的，所述表面等离子体共振传感芯片为经磁控溅射在玻璃载玻片上依次镀铬层、镀金层，再经11-巯基-1-十一醇溶液浸泡修饰而成。
优选的，所述铬层的厚度为1.5～2nm;金层的厚度为45～47nm;所述11-巯基-1-十一醇溶液的浓度为1mM;所述浸泡时间为10～12h。
优选的，光路全内反射入射角为：调节入射激光角度至反射光强度为发生全内反射时强度的三分之一。
优选的，所述CCD相机采集参数为：采样速度为106.7fps，采集帧数为3000帧，采集频率为106.7Hz，曝光时间为5000μs。
优选的，步骤D)所述细菌毒性分析具体为：采用matlab代码提取单个细菌的表面等离子体共振强度信息值，根据消逝波在表面随垂直距离增加而指数衰减的特性，计算出细菌的垂直位置变化，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。
优选的，所述毒理学模型包括Logistic模型。
优选的，所述细菌为Escherichia coli JM109;
所述细菌培养方法具体为：从细菌培养LB平板中挑取单克隆E.coli JM109菌落，接种进LB培养基中，在恒温摇床中35～37℃震荡培养10～12h,离心收取细菌菌体，并用1×磷酸盐缓冲溶液洗涤，最后分散于1×磷酸盐缓冲溶液至细菌OD600值为0.2。
与现有技术相比，本发明提供了一种测定废水急性毒性的单细菌表面等离子体机械振动成像方法，包括：A)细菌表面固定：将细菌悬浊液加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中，粘附于传感芯片表面;B)废水样品处理：将废水样品加入表面等离子体机械振动成像系统样品池中;C)细菌振动分析：采用CCD相机采集细菌等离子体共振信号变化;D)细菌毒性分析：根据成像得到单细菌等离子体共振信号变化，经计算得出细菌位置振动幅度信息，带入毒理学模型，得到废水的急性毒性数值。本发明利用表面等离子体机械振动成像系统，单细菌的纳米振动可以被实时采集分析。通过观察系统中细菌在加入废水样品后振动的衰减情况，即可快速监测废水急性毒性信息。相比传统急性毒性分析方法，本发明具备速度快和抗干扰的优势。因为单细菌纳米机械振动传感依靠的是高频率的细菌纳米振动信息，不易受基质静态背景干扰，并且由于分析的是机械振动振动信息，分析结果不易受溶液色度、盐度、硬度的影响，结果准确。