申请日2013.06.27
公开(公告)日2013.09.25
IPC分类号C12N1/20; C12R1/145; C02F3/28; C02F3/34
摘要
本发明公开了一株产酸的梭菌属菌株，该菌株已于2012年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏信息为：梭菌属(Clostridium sp.)YC3 CCTCC NO:M2012555。本发明还公开了所述菌株与盐单胞菌混合在造纸废水处理中的应用，本发明的菌株不仅具有直接处理造纸废水的能力，并且还能够使废水的pH降低，为产甲烷菌在造纸黑液中的生长和定殖提供了适宜环境。作为一种初级处理方法，本发明对造纸废水后续的处理提供了有利的条件，增强了回收效率，降低了成本并减少了二次污染，在造纸废水治理方面具有很大的应用前景。
权利要求书
1.一株产酸的梭菌属菌株，其特征在于：所述菌株是产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3，该菌株已于2012年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2012555。
2.权利要求1所述产酸的梭菌属菌株在造纸废水处理中的应用，方法是：(1)取产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555在无菌条件下接种于含有50mL液体种子培养基的100mL的厌氧瓶中，在30～37℃条件下，静置厌氧培养至OD达到9～10，得到一级种子;其中，液体种子培养基配方为：1升蒸馏水中含10克葡萄糖，5克酵母粉，2克蛋白胨，5克NaCl，2.5克KH2PO4，2克MgSO4，pH9.0，在厌氧培养箱中分装入厌氧瓶中，115℃条件下灭菌30分钟;
(2)以体积比为5%的接种量，将上述一级种子接种于含有50mL液体发酵培养基的100ml的厌氧瓶中，在30～37℃条件下，静置厌氧培养到OD达到18～20，得到二级种子;其中，液体发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含15克葡萄糖，5克酵母粉，5克豆粕粉，5克NaCl，3克KH2PO4，2克MgSO4，pH9.0，装入5L发酵罐中，115℃条件下灭菌30分钟;
(3)以体积比为5%～10%的接种量，将上述二级种子接种于含有3L液体发酵培养基的5L发酵罐中，持续通入氮气保持无氧环境，在30～37℃条件下培养到OD达到18～20，得到产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555的菌液;同时，选择菌株盐单胞菌(Halomonas sp.)Y2CCTCC NO:M208188和盐单胞菌(Halomonas sp.)19-A CCTCC NO:M208186分别在无菌条件下接种于含有5mL完全液体种子培养基的摇管中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养至OD达到9～10，分别得到两种盐单胞菌一级种子;以体积比为5%的接种量，将上述两种盐单胞菌一级种子分别接种于含有100mL完全液体培养基的300ml的三角瓶中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养至OD达到9～10，分别得到两种盐单胞菌二级种子;以体积比为5%～10%的接种量，将上述两种盐单胞菌二级种子分别接种于含有3L完全液体培养基的5L发酵罐中，30±1℃条件下培养到OD达到15～16，分别得到盐单胞菌(Halomonas sp.)Y2和盐单胞菌(Halomonas sp.)19-A的菌液;其中，完全液体培养基的配方为：1升蒸馏水中含10克葡萄糖，10克蛋白胨，5克酵母膏，10克牛肉膏，5克NaCl，1ml的金属离子混合液，pH=8.0～8.5，115℃条件下灭菌2分钟，其中所述金属离子混合液的配方：1升蒸馏水中含ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl2·4H20.5g;Na2MoO4·2H2O0.1g;CuCl2·2H2O0.05g;Na2WO4·2H2O0.05g;HCl120mmol/L;
(4)将产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555的菌液与盐单胞菌(Halomonas sp.)Y2CCTCC NO:M208188和盐单胞菌(Halomonas sp.)19-A CCTCCNO:M208186按照体积比为1:1:1混合，得到用于处理造纸废水混合菌液;
(5)将用于处理造纸废水混合菌液与厌氧污泥按照体积比为1:3的比例混合成适用于处理造纸废水的构建菌群;
(6)选择碱性草浆造纸黑液为造纸废水 样本，其中所述草浆造纸废水pH=11～12，COD=11000～120,000mg L-1，然后按照草浆造纸废水1L、适用于处理造纸废水的构建菌群3～4L、水5～6L的比例量将其混合，再接入到上流式厌氧反应器(UASB)中，在35～38℃条件下反应，72小时后每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释10倍的草浆造纸废水，处理过程中间隔取样测定草浆造纸废水的pH和COD指标，待其pH=8～9、COD去
除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释5倍的浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释3.3倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释2.5倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释2倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释1.6倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释1.4倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释1.25倍的草浆造纸废水，并持续溜加5～18个月，实现对造纸废水的处理。
3.如权利要求2所述产酸的梭菌属菌株在造纸废水处理中的应用，其特征在于：步骤(5)所述厌氧污泥取自葡萄酒厂废水处理池。
说明书
一株产酸的梭菌及其在造纸废水处理中的应用
技术领域
本发明涉及一株产酸的梭菌属菌株及其在废水处理中的应用，尤其涉及一株产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3及其在造纸废水(草浆造纸黑液)处理中的应用。
背景技术
来源于麦草原料的造纸黑液具有很高的pH和COD负荷(pH11～13，COD>10,0000mgL-1)，是一种处理难度大的强碱性人工废水。草浆造纸黑液由于具有粘度高、热值低等特点，导致在木浆造纸废水处理中广泛应用的碱回收技术无法大规模应用。酸析法也是处理草浆造纸黑液的常用方法，但该方法存在二次污染(木质素沉淀)、大量的无机酸消耗引起的高处理成本等缺点。近年来，由于微生物处理能够从根本上消除造纸黑液污染，并具有处理成本低及运行简单等特点，因此造纸黑液的微生物处理方法受到了环保工作者们的普遍重视。研究者们分离到了各种微生物如白腐菌和一些细菌等用于造纸黑液的处理研究。
但综合国内外文献报道，目前在造纸黑液的生物处理中仍然存在着一个很大的难点：用于黑液处理的菌株都不能同时耐受黑液高pH和高COD的极端环境;同样利用微生物菌群来进行造纸黑液处理的传统生物处理法如活性污泥法、厌氧生物处理法等也存在着类似的问题，因此目前的生物处理法都需要在处理前将黑液COD和pH调至较低的水平，这种大量稀释的工艺在实际应用中是不可行的，从而使得生物处理方法只能作为二级处理方法在黑液处理中应用。因此，在利用菌群来处理造纸废水的应用中，虽然活性污泥和氧化塘在造纸废水的二次处理上具有发挥了比较好的作用，但具有不能对造纸废水进行直接的处理的缺点。也曾有一些专利提出采用产酸菌群处理造纸废水，但对于具体处理效果(如废水最重要的指标之一COD)、菌群特性及菌群构建过程等没有给出描述;前期申请人通过构建菌群对造纸黑液进行好氧与兼性处理，获得了较好的应用效果并获得专利，但对于造纸黑液厌氧处理的资源化利用没有涉及(ZL200810158631.0)。
在前期专利的基础上，申请人从碱性造纸黑液中进一步分离获得了一株厌氧产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3。与标准菌株相比，该菌株具有在碱性条件下生长迅速、产酸产氢能力强的特点。经检索，利用产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3处理草浆造纸废水未见报道。
发明内容
针对现有草浆造纸废水处理中的问题，本发明提供了一株产酸的梭菌属(Clostridiumsp.)菌株YC3及其在造纸废水处理中的应用。
本发明所述的产酸的梭菌，其特征在于：所述菌株是梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3，该菌株已于2012年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO:M2012555。
上述产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555为革兰氏阳性 厌氧杆菌。产生芽孢，孢子卵圆，偏心或次端生。在普通营养琼脂培养基中生长良好。其最适生长温度在30℃;生长pH范围广泛，最适pH为9.0。
上述产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555生理生化特征如表1所示(生理生化方法选择参照Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology-9，1994)。
注：+表示结果是阳性;一表示阴性结果。
本发明所述产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555的16S rDNA基因序列长度为1383bp，序列如SEQ ID No.1所示。
通过在美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查阅国际相关的基因库，本发明的产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555与Clostridium属其它菌株如Clostridium butyricum EB6的16S rDNA基因序列具有99%左右的序列相似性。
本发明所述产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555在造纸废水处理中的应用，方法是：
(1)取产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555在无菌条件下接种于含有50mL液体种子培养基的100mL的厌氧瓶中，在30～37℃条件下，静置厌氧培养至OD达到9～10，得到一级种子;
其中，液体种子培养基配方为：1升蒸馏水中含10克葡萄糖，5克酵母粉，2克蛋白胨，5克NaCl，2.5克KH2PO4，2克MgSO4，pH9.0，在厌氧培养箱中分装入厌氧瓶中，115℃条件下灭菌30分钟;
(2)以体积比为5%的接种量，将上述一级种子接种于含有50mL液体发酵培养基的 100ml的厌氧瓶中，在30～37℃条件下，静置厌氧培养到OD达到18～20，得到二级种子;
其中，液体发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含15克葡萄糖，5克酵母粉，5克豆粕粉，5克NaCl，3克KH2PO4，2克MgSO4，pH9.0，装入5L发酵罐中，115℃条件下灭菌30分钟;
(3)以体积比为5%～10%的接种量，将上述二级种子接种于含有3L液体发酵培养基的5L发酵罐中，持续通入氮气保持无氧环境，在30～37℃条件下培养到OD达到18～20，得到产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555的菌液;
同时，选择菌株盐单胞菌(Halomonas sp.)Y2CCTCC NO:M208188和盐单胞菌(Halomonas sp.)19-A CCTCC NO:M208186分别在无菌条件下接种于含有5mL完全液体种子培养基的摇管中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养至OD达到9～10，分别得到两种盐单胞菌一级种子;
以体积比为5%的接种量，将上述两种盐单胞菌一级种子分别接种于含有100mL完全液体培养基的300ml的三角瓶中，30±1℃条件下在120～200转/分摇床上振荡培养至OD达到9～10，分别得到两种盐单胞菌二级种子;
以体积比为5%～10%的接种量，将上述两种盐单胞菌二级种子分别接种于含有3L完全液体培养基的5L发酵罐中，30±1℃条件下培养到OD达到15～16，分别得到盐单胞菌(Halomonas sp.)Y2和盐单胞菌(Halomonas sp.)19-A的菌液;
其中，完全液体培养基的配方为：1升蒸馏水中含10克葡萄糖，10克蛋白胨，5克酵母膏，10克牛肉膏，5克NaCl，1ml的金属离子混合液，pH=8.0～8.5，115℃条件下灭菌20分钟，其中所述金属离子混合液的配方：1升蒸馏水中含ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl2·4H2O0.5g;Na2MoO4·2H2O0.1g;CuCl2·2H2O0.05g;Na2WO4·2H2O0.05g;HCl120mmol/L;
(4)将产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555的菌液与盐单胞菌(Halomonas sp.)Y2CCTCC NO:M208188和盐单胞菌(Halomonas sp.)19-A CCTCCNO:M208186按照体积比为1:1:1混合，得到用于处理造纸废水混合菌液;
(5)将用于处理造纸废水混合菌液与厌氧污泥按照体积比为1:3的比例混合成适用于处理造纸废水的构建菌群;
(6)选择碱性草浆造纸黑液为造纸废水样本，其中所述草浆造纸废水pH=11～12，COD=11000～120,000mg L-1，然后按照草浆造纸废水1L、适用于处理造纸废水的构建菌群3～4L、水5～6L的比例量将其混合，再接入到上流式厌氧反应器(UASB)中，在35～38℃条件下反应，72小时后每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释10倍的草浆造纸废水，处理过程中间隔取样测定草浆造纸废水的pH和COD指标，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释5倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释3.3倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释2.5倍的草浆造纸 废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释2倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释1.6倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释1.4倍的草浆造纸废水，待其pH=8～9、COD去除率达到50%～60%后，每天向上流式厌氧反应器中溜加500～1000ml的用水稀释1.25倍的草浆造纸废水，并持续溜加5～18个月，实现对造纸废水的处理。
上述产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3在造纸废水处理中的应用中：步骤(5)所述厌氧污泥优选取自葡萄酒厂废水处理池。
本发明在造纸废水(草浆造纸黑液)中成功筛选出了产酸的梭菌属(Clostridium sp.)菌株YC3CCTCC NO:M2012555，该菌株具有耐受高pH、生长快、产酸能力强等特点。与原始厌氧污泥相比，添加该菌株后的厌氧污泥经驯化后用于造纸黑液厌氧处理具有处理能力强、处理效果好的优点。本发明的菌株不仅具有直接处理造纸废水的能力，并且还能够使废水的pH降低，为产甲烷菌在造纸黑液中的生长和定殖提供了适宜环境。作为一种初级处理方法，本发明对造纸废水后续的处理提供了有利的条件，增强了回收效率，降低了成本并减少了二次污染，在造纸废水治理方面具有很大的应用前景。