申请日2018.01.27
公开(公告)日2018.06.19
IPC分类号C02F3/34; C12N1/38; C12N1/20; C12R1/38
摘要
本发明属于废水生物强化处理领域，具体涉及一种提高日用化工废水微生物处理效果的激活促进剂。日用化工废水具有高有机物、高盐和生物毒性等特点，使用常规生物法处理难以达标。本发明使用壳聚糖、甜菜碱、硫酸亚铁、海藻糖、柠檬酸、脯氨酸、复合维生素，提供了一种激活促进剂，可有效改善微生物在高有机物、高盐条件下的生存繁殖能力和代谢活性，有效提高污水处理效果。本发明成本低廉、制作方便，可实际应用于日用化工废水及其他高盐表面活性剂废水的生物处理过程。
权利要求书
1.一种微生物激活促进剂，其特征在于：以1L水为溶剂，组分包括：甜菜碱5～35g，柠檬酸25～175g，硫酸亚铁45～100g，脯氨酸5～35g，壳聚糖120～200g，海藻糖2～10g，复合维生素0.10～0.50g;所述柠檬酸的质量是脯氨酸质量的4～5倍。
2.根据权利要求1所述的所述一种微生物激活促进剂，其特征在于：所述的复合维生素的制备方法为：将硫胺素、叶酸和生物素按质量比为1:1:1的比例添加至1L蒸馏水中，充分混匀，即得。
3.根据权利要求1所述的所述一种微生物激活促进剂，其特征在于：所述壳聚糖140～180g。
4.根据权利要求1所述的一种微生物激活促进剂，其特征在于：所述的甜菜碱10～25g，柠檬酸50～100g，硫酸亚铁50～80g，脯氨酸10～20g，海藻糖2～6g，复合维生素0.20～0.35g。
5.权利要求1所述微生物激活促进剂的使用方法，其特征在于：具体步骤包括：
(1)在待处理废水中接种复合微生物菌剂，接种量为10%、OD600=0.1～0.2;
(2)在已接种复合微生物菌剂的废水中添加所述的微生物激活促进剂，添加比例为：每千升废水添加一升微生物激活促进剂，工作温度为：15～30℃。
6.权利要求5所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)废水准备：将SDS和Brij35以质量比为1:1的比例充分溶解于水中，获得初始浓度为1500mg COD/L的废水，再添加20～30g/L NaCl，即得废水;
(2)将Pseudomonas sp.SDS-N2菌液和Pseudomonas pseudoalcaligenes sp.PG-1菌液按体积比为1:1接种于步骤(1)的废水中，混合培养，混菌总接种量为20%;
(3)按质量比为：COD:N:P=200:5:1的比例添加N、P入步骤(1)所述废水中，再添加微量元素5mL/L，在温度为28℃、pH=8.0±0.5且溶氧充足的环境下，连续培养24h，即得复合微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述微量元素的制备方法为：以1L水为溶剂，EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L,CaCl2 0.055g/L,MnCl2·4H2O 0.051g/L,FeSO4·7H2O 0.049g/L,(NH4)2Mo7O24·4H2O 0.011g/L,CuSO4·5H2O0.0157g/L,CoCl2·6H2O 0.016g/L,使用KOH调节pH=6.0。
8.权利要求5或6或7所述的复合微生物菌剂在化工废水中的应用。
说明书
一种提高日用化工废水微生物处理效果的激活促进剂
技术领域
本发明属于废水生物强化处理领域，具体涉及一种提高日用化工行业废水微生物处理效果的激活促进剂。
背景技术
日用化工废水，是指日用化工产品(如香波、洗手液、洗衣液以及洗衣粉等)生产过程中产生的废水。该类废水的主要特点为排放量大、有机物(主要含表面活性剂，包括阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠SDS和非离子表面活性剂平平加类)浓度高、含盐量大。若不经有效控制与处理，废水中的表面活性剂会在环境中缓慢积累并对生态系统造成危害。
当前关于含高盐日用化工废水的处理的报道并不多见，已报道的处理方法主要包括Fenton法(Fenton法处理高浓度硫酸盐的日用化工废水)和Fenton法-接触氧化法联合处理(Fenton氧化-好氧接触工艺处理高浓度硫酸盐的LAS废水;高浓度日用化工废水处理研究)，这些方法在使用过程中存在药剂消耗量大，成本较高，操作较复杂等缺点。当前，对高盐废水的处理以物理化学法居多。如借助蒸发结晶(一种高含盐脱硫废水深度处理方法及系统;高盐废水低温多效蒸发-MVR蒸发结晶组合工艺;一种高盐废水的处理方法;)、吸附(一种高含盐有机废水处理装置)以及膜截留(一种用于高盐废水处理的有机硅复合膜)等方法可对高盐废水进行有效处理。须指出的是，尽管这些方法虽然能较好的去除废水中高浓度的盐，但是这些设备或者材料生产和使用成本较高;此外，大多数高盐废水中同时存在其他污染物质，仅仅通过上述方法不能有效去除高盐废水中的其他污染物。生物处理方面，湛永航等报道了一种生物转盘和低温MVR干燥设备联合处理高盐废水的方法(一种含盐废水零排放处理装置及处理方法)，但该方法未对微生物对含盐废水的适应性和处理效果做说明;李津等报道了一种高盐低温废水处理用强化剂及方法，其作用原理是通过添加强化剂来调节微生物细胞的渗透压，从而使微生物能在高盐废水生物处理中发挥作用(一种高盐低温废水处理用强化剂及方法)。该技术方法应用过程中，主要作用在于调节微生物细胞的渗透压，强化剂的投加量为5～25公斤/吨水，使用成本较高。综合比较各类方法的应用成本和操作复杂程度，微生物处理此类废水具有一定的技术和成本优势。高效处理此类废水的关键在于采取措施以提高微生物细胞对高盐条件的耐受性与对表面活性剂的降解活性。
因此，提出一种提高微生物在高盐日用化工废水中降解活性的微生物激活促进剂，可显著降低废水处理成本，且对环境友好，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高日用化工废水微生物处理效果的激活促进剂。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种微生物激活促进剂，以1L水为溶剂，组分包括：甜菜碱5～35g，柠檬酸25～175g，硫酸亚铁45～100g，脯氨酸5～35g，壳聚糖120～200g，海藻糖2～10g，复合维生素0.10～0.50g，所述柠檬酸的质量是脯氨酸质量的4～5倍。
优选的，所述复合维生素的制备方法为：将硫胺素、叶酸和生物素按质量比为1:1:1的比例添加至1L蒸馏水中，充分混匀，即得。
优选的，所述壳聚糖140～180g。
优选的，所述的甜菜碱10～25g，柠檬酸50～100g，硫酸亚铁50～80g，脯氨酸10～20g，海藻糖2～6g，复合维生素0.20～0.35g。
相应的，所述微生物激活促进剂的使用方法，具体步骤包括：
(1)按接种量为10%、OD600=0.1～0.2，在待处理废水中接种复合微生物菌剂;
(2)在已接种复合微生物菌剂的废水中添加所述的微生物激活促进剂，每千升废水中微生物激活促进剂的添加量为一升，工作温度为：15～30℃。
相应的，所述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)废水样本制备：将SDS和Brij35以质量比为1:1的比例添加，充分溶解于水中，获得初始浓度为1500mg COD/L的废水，再添加20～30g/L NaCl，即得废水;
(2)将Pseudomonas sp.SDS-N2菌液和Pseudomonas pseudoalcaligenes sp.PG-1菌液按体积比为1:1接种于步骤(1)的废水中，混合培养，混菌总接种量为20%;
(3)按质量比，COD:N:P=200:5:1的比例添加N、P入步骤(1)所述废水中，再添加微量元素5mL/L，在温度为28℃、pH=8.0±0.5且溶氧充足的环境下，连续培养24h，即得复合微生物菌剂。
优选的，所述微量元素制备方法为：以1L水为溶剂，充分溶解：EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L,CaCl2 0.055g/L,MnCl2·4H2O0.051g/L,FeSO4·7H2O 0.049g/L,(NH4)2Mo7O24·4H2O 0.011g/L,CuSO4·5H2O0.0157g/L,CoCl2·6H2O 0.016g/L,使用KOH调节pH=6.0。
相应的，所述的复合微生物菌剂在日用化工废水中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明针对日用化工废水处理过程中，高盐环境影响微生物细胞渗透压及降解活性，导致表面活性剂降解速率慢、处理效果不佳等问题，提供一种适用于高盐日用化工废水(主要是阴离子表面活性剂SDS和非离子表面活性剂Brij35)微生物处理的激活促进剂制备方法及其应用效果，可显著提高高盐环境下日用化工废水生物处理能力。
2、本发明从多方面综合促进了微生物的活性。其中：脯氨酸、海藻糖可维持高盐环境中微生物细胞的渗透压，维持微生物细胞的稳定性和流动性，能非特异性的保护生物大分子和生物体，提高微生物的耐高盐能力。柠檬酸参与微生物体内的三羧酸循环，可促进ATP的产生，提高微生物的代谢活性。亚铁离子是许多酶的活性中心位点，适当加入可促进酶活性，进而提高微生物的代谢活性。甜菜碱可以调解微生物细胞的渗透压，使细胞内外维持渗透平衡;此外，甜菜碱在微生物抗高盐引起的氧化胁迫、保护微生物的呼吸作用、酶的能量代谢等过程具有重要作用。复合维生素作为生长因子能有效促进微生物的生长;壳聚糖具有一定的吸附絮凝作用，可将微生物集聚成团，从而降低外界不利因素的干扰。
3、使用本发明方案制备的微生物激活促进剂，添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
(1)柠檬酸用量为脯氨酸用量的15倍及以上时，它们可能发生抗氧化、促生长和维持微生物的渗透压的联合作用，本发明的柠檬酸用量只为脯氨酸的5倍，微生物生长却达到了与常规用量相当甚至更好的效果，这可能是因为本发明添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
(2)亚铁离子可促进微生物的酶活性，但一般使用浓度为5～45mg/L时效果较好(如：“亚铁对水平潜流人工湿地反硝化作用的影响”;“Effects of Fe2+concentration onbiomass accumulation and energy metabolism in photosynthetic bacteriawastewater treatment”)，但本发明的亚铁离子用量为50～80mg/L，明显高于常规用量，微生物生长却达到了与常规用量相当甚至更好的效果，这可能是因为本发明添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
(3)壳聚糖具有吸附絮凝作用，可将微生物集聚成团从而降低外界不利因素对微生物细胞的影响，但过量的壳聚糖过量又会抑制微生物细胞的活性。一般地，壳聚糖的添加量在120mg/L以下为宜。本研究中，壳聚糖的添加量达到140～180mg/L，明显高于常规用量，微生物生长却达到了与常规用量相当甚至更好的效果，这可能是因为本发明添加的多种物质间发生了未知的联合作用。
4、经试验证明，本发明的微生物激活促进剂可有效促进高盐条件下微生物的生长和代谢活性，提高污染物去除效率，明显减少运行能耗，经济效益明显。同时，该微生物激活促进剂，制备简单，成本低廉，使用方便。
具体实施方式
1、废水样本制备：
将SDS和Brij35以1:1(w/w，质量比)的比例添加，盐(NaCl)浓度为20～30g/L，充分溶解于水中，获得初始浓度为1500mg COD/L的高盐日用化工废水，作为全文待处理废水样本。
2、复合微生物菌剂制备：
(1)SDS降解菌来自四川省德阳市的土壤筛选，采用平板划线法。具体步骤为：
1)取土壤20mL，置于含1g/L SDS的液体培养基中进行驯化培养。
所述液体培养基为：Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，(NH4)SO4 0.3g/L，微量元素5mL/L，SDS 1.0g/L,pH=8.0;
所述微量元素为：以1L水为溶剂，组分包括：EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl2 0.055g/L，MnCl2·4H2O 0.051g/L，FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O0.011g/L，CuSO4·5H2O0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，pH=6.0(KOH)。
2)当土壤样品对SDS去除率在24h内超过90%时，取1mL样品，用蒸馏水进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，分别各取0.2mL稀释液涂布于1g/L SDS固体培养基中，置于培养箱中在30℃恒温条件下培养24～72h，培养至长出肉眼可见的菌落;
所述SDS固体培养基制备方法为：在步骤1)所述液体培养基中添加0.2%的琼脂粉。
3)挑取长势较快的单菌落于1g/LSDS固体培养基中，并通过划线分离法对菌落进行纯化操作，如此反复操作3～4次，以保证得到纯种菌株。挑取单菌落，将菌株接种到SDS固体培养基中，置于4℃冰箱保藏。
(2)Birj35降解菌来自四川省德阳市的土壤筛选，采用平板划线法。具体步骤为：
1)取土壤20mL，置于含0.5g/L Birj35的液体培养基中进行驯化培养。
所述液体培养基为：Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，(NH4)SO4 0.3g/L，微量元素5ml/L，Brij35 0.5g/L,pH=8.0;
所述微量元素为：以1L水为溶剂，组分包括：EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl2 0.055g/L，MnCl2·4H2O 0.051g/L，FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O0.011g/L，CuSO4·5H2O0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，pH=6.0(KOH)。
2)当土壤样品对Birj35去除率在24h内超过90%时，取1mL样品用蒸馏水进行梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，分别各取0.2mL稀释液涂布于0.5g/L Birj35固体培养基中，置于培养箱中在30℃恒温条件下培养24～72h，培养至长出肉眼可见的菌落。
所述Birj35固体培养基制备方法为：在步骤1)所述液体培养基中添加0.2%的琼脂粉。
3)挑取长势较快的单菌落于0.5g/L Birj35固体培养基中，并通过划线分离法对菌落进行纯化操作，如此反复操作3～4次，以保证得到纯种菌株。挑取单菌落，将菌株接种到Birj35固体培养基中，置于4℃冰箱保藏。
(2)挑一株保存于4℃SDS固体培养基的Pseudomonas sp.SDS-N2菌株(GenbankNo.MF457589，DNA序列如SEQ ID NO 1所示)，置于含1000mg/L SDS的已灭菌的LB培养基中，于28℃下恒温培养12h，菌液OD值达1.0～1.5。
(3)挑一株保存于4℃Birj35固体培养基斜面的Pseudomonas pseudoalcaligenessp.PG-1菌株(Genbank No.MG255175，DNA序列如SEQ ID NO 2所示)，置于含500mg/LBrij35的已灭菌的LB培养基中，于28℃下恒温培养12h，菌液OD值达到0.6～1.0。
(4)将上述Pseudomonas sp.SDS-N2菌液和Pseudomonas pseudoalcaligenessp.PG-1菌液按1:1(v/v，体积比)的比例接种并混合培养，混菌总接种量为20%，将SDS:Brij35按质量比1:1添加(终浓度为1500mg COD/L左右)，添加足量氮磷元素(质量比，COD:N:P=200:20:1)以及微量元素5mL/L，培养温度为28℃，pH为8.0±0.5，溶解氧充足，连续培养24h，即得复合微生物菌剂。
(5)其中，所述微量元素的制备方法为：以1L水为溶剂，充分溶解：EDTA 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CaCl2 0.055g/L，MnCl2·4H2O0.051g/L，FeSO4·7H2O 0.049g/L，(NH4)2Mo7O24·4H2O 0.011g/L，CuSO4·5H2O 0.0157g/L，CoCl2·6H2O 0.016g/L，pH=6.0(KOH)。
3、复合维生素制备：
将硫胺素、叶酸和生物素按1:1:1(质量比)的比例添加至1L蒸馏水中，充分混匀，即获得复合维生素，浓度为0.1～0.5g/L。
4、数据测定
(1)蛋白质含量测定
蛋白含量测定采用碧云天(Beyotime)公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒检测，蛋白浓度检测仪器为多功能酶标仪(EnVision，美国PerkinElmer公司)。具体检测步骤为：
1)先将试剂A(试剂盒中自带试剂，产品编号：P0012-1)摇晃混匀，根据样品数量，按50体积试剂A加1体积试剂B(试剂盒中自带试剂，产品编号：P0012-2)试剂配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。
2)稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品(5mg/mL BSA，-20℃保存)取10微升用PBS稀释至100μL(用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。
将稀释后的标准品(0.5mg/mL)按0μL，2μL，4μL，6μL，8μL，12μL，16μL，20μL分別加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。
3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。
4)在各孔中加入200μL BCA工作液，使用加样枪轻柔吹打，将其中液体混匀，然后在37℃室内放置30～60min。将液体冷却至室温，在酶标仪上测定562nm波长下的吸光值，最后根据标准曲线计算出蛋白质的浓度(mg/L)。
(2)电子传递体系(ETS)活性测定
ETS活性采用INT-ETS方法测定。该方法的原理为：以碘硝基四氮唑[2-(ρ-iodophenyl)-3-(ρ-nitrophenyl)-5-phenyl Tetrazolium Chloride，INT]为人工电子受体，INT在接受电子后产生紫红色的还原产物三苯基甲酯，从而可间接反映微生物的活性。ETS具体检测步骤如下：
取菌液取1mL以8000rpm离心5min，弃去上清液，样品用PBS缓冲溶液(pH 8.4)洗涤离心处理3次，最后用PBS缓冲液(pH 8.4)补足至取样体积并混合均匀。加入0.5mL 0.2%INT溶液、2mL 0.1mol/L葡萄糖溶液，在37℃下避光振荡培养1h。加入甲醛(添加量为样品量的2%)终止反应，再离心3min(10000rpm)，弃去上清液，加入1mL乙醇，1mL丙酮，在(37±1)℃下暗处振荡萃取15min。在10000rpm下离心3min，取上层溶液于485nm处测定吸光度值，换算为ETS活性。
(3)化学需氧量(COD)的测定
COD是指在一定条件下，氧化1L水样中还原性物质所消耗的氧化剂的量，用氧的mg/L表示;测定采用《水质化学需氧量的测定-重铬酸盐法》(GB 11914-89)。具体步骤如下：
1)取20.00mL混合均匀的水样(或适量水样稀释至20.00mL)置于250mL磨口的回流锥形瓶中,准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液及数颗防暴沸玻璃珠，连接磨口回流冷凝管，从冷凝管上端缓慢加入30mL硫酸-硫酸银溶液，不断旋动锥形瓶使之混匀。自溶液开始沸腾起加热回流2h。
2)冷却后，用20～30mL水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶。溶液总体积不得少于140mL。
3)溶液冷却至室温后，加3滴试亚铁灵指示液，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。
4)测定水样的同时，取20.00mL重蒸馏水，按同样操作空白实验。记录滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。
计算公式：
式中，c—硫酸亚铁铵标准溶液的浓度(mol/L);
V1—滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的耗量(mL);
V2—滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的耗量(mL);
V—水样体积(mL);
8—氧(1/2O2)摩尔质量(g/mol)。