申请日2004.06.30
公开(公告)日2007.01.10
IPC分类号C12N1/00; C02F3/34
摘要
一种特效菌株降解处理合成制药废水的方法，由白腐真菌(亲株1)、土著细菌XZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株菌体的原生质体融合，用所述基因工程菌处理制药废水：废水先经调节池进行酸碱调节，pH值，6.8-8.0;然后在反应器中曝气、沉淀，并将污泥池中污泥回流至曝气反应池，处理温度，30±2℃;反应器中溶解氧≥2mg/L;菌体浓度，2-10g/L。本发明降解合成制药废水的最大比降解率qmax=11.188d-1，具有高降解、高絮凝、高适应优势;提高生物负荷效率56%以上，节约68%反应器体积的建筑费用。原生质体融合不产生新基因，NJU-Xhhh1特效菌株不存在基因污染问题。
权利要求书
1、一种工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是由亲株1白腐真菌、亲 株2土著细菌、亲株3酿酒酵母三个亲株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细 胞内的重组整合，构建获得的基因工程菌;然后用所述基因工程菌处理制药废水的方 法是：废水先经调节池进行酸碱调节，pH值，6.8-8.0;然后在反应器中曝气、沉淀， 并将污泥池中污泥回流至曝气反应池，其处理工艺参数为：处理温度，30±2℃;反应 器中溶解氧≥2mg/L;菌体浓度，2-10g/L。
2、由权利要求1所述的工程菌剂的制备方法，其特征是;在含P、N营养元素中 处理，所述P、N营养元素矿物盐包括Na2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、CaCl2、 FeSO4·7H2O。
3、由权利要求1所述的工程菌剂的制备方法，其特征是制备所述基因工程菌的 液体培养基的组成是：1000ml中：K2HPO4 3g;KH2PO4 1g;NH4NO3 0.5g;Na2SO4 0.1g; MgSO4·7H2O; 10mg;MnSO4·4H2O 1mg;CaCl2 0.5mg;FeSO4·7H2O 1mg;CH3COONa 5g; 酵母浸膏5g;蛋白胨10g;葡萄糖10g;200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0;培养方 法是在121℃、103kPa、湿热灭菌20min后，接种发酵，培养温度：33-37℃;pH：7.0， 发酵10-25小时。
4、由权利要求1所述的工程菌剂的制备方法，其特征是所述基因工程菌剂制备 物保存在抗氧化剂巯基乙醇终浓度0.1-0.3‰+Fe3+终浓度0.1-0.14%的工程菌剂发酵 液中。
5、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是污泥 回流浓度控制为5-5.5kg/m3;水力停留时间为0.6-0.65d;污泥停留时间为20-22d; 回流量控制为100%。
6、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是污泥 回流浓度控制为5.395kg/m3。
7、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是水力 停留时间为0.6-0.65d。
8、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是污泥 停留时间为20-22d。
9、由权利要求1所述的工程菌剂降解处理合成制药废水的方法，其特征是经过 二至三次反应器中曝气。
说明书
工程菌株处理合成制药废水的生物技术方法
技术领域
本发明涉及一种工程微生物Xhhh菌株处理合成制药废水的生物技术方法。
背景技术
国际上已有多种处理废水工程菌株，但是没有应用原生质体融合工程菌株处 理合成制药废水的专利。典型的如日本的EM，又如美国PARADISF公司的高智 能微生物HIMP(High-Intelligence Microorganism Preparation)等.而国内外 应用原生质体融合工程菌株专用于处理合成制药废水目前仍是空白。如某公司合 成生产神经调节类药物，废水中含有机氯及其它苯环与杂环化等有机污染物，其 中持久性有机污染物POPs(persistent organic pollutants)及环境激素EH (environmental hormone)类污染物多达16种以上。它们难以被土著微生物快 速降解，对人类存在着致癌症和降低精子数量与质量的分子遗传毒性，对环境潜 在着破坏生物多样性的分子生态毒性。现有的菌种不能有效和长期稳定的处理高 浓度的制药有机废水。
发明内容
本发明目的是提供原生质体融合工程菌株高效处理合成制药废水的方法。尤 其是应用本发明构建的原创性的基因工程工程菌NJU-Xhhh1为出发菌株，具有白 腐真菌的高降解性、土著细菌XZ1的高适应性、酿酒酵母的高絮凝性，利于高效 处理合成制药有机废水。
本发明的目的是这样实现的：将原创性工程菌株处理合成制药有机废水生物 技术。(1).技术构思：以本发明构建的原创性的基因工程工程菌NJU-Xhhh1为出 发菌株，菌株具有白腐真菌的高降解性、土著细菌XZ1的高适应性、酿酒酵母的 高絮凝性，利于高效处理合成制药有机废水。配套相关的应用技术，在国内外具 有原创性与持久性。
(2).技术构成：
出发菌株NJU-Xhhh1工程菌：是本发明的原创性科研成果。NJU-Xhhh1工 程菌由白腐真菌(亲株1)、土著细菌XZ1(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲 株菌体的原生质体融合，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得的基因 工程菌，即中国微生物菌种普通微生物中心的1087号微生物。NJU-Xhhh1工程 菌集中了三个亲株的高降解性、高适应性、高絮凝性的三高优势，利于高效处理 制药有机废水。国际公认原生质体融合构建的新菌株，不存在基因污染问题，所 以NJU-Xhhh1工程菌剂也不存在基因污染问题。
用所述基因工程菌处理制药废水的方法是：废水先经调节池进行酸碱调节， pH值，6.8-8.0;然后在反应器中曝气、沉淀，并将污泥池中污泥回流至曝气反 应池，其处理工艺参数为：处理温度，30±2℃;反应器中溶解氧≥2mg/L;菌体 浓度，2-10g/L。
NJU-Xhhh1工程菌由 亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、 亲 株2土著细菌XZ1(Bacillus)、 亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原 生质体融合而成。先经原生质体制备：用蜗牛酶脱去真菌的细胞壁或用溶菌酶脱 去细菌的细胞壁、生成原生质体并经离心收集原生质体、缓冲液清洗后获得，然 后进行二次融合，第一次融合：等量的 亲株1白腐真菌细胞和 亲株2土著细菌 YZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇(PEG，MW=6000)、和CaCl2、蔗糖配制 的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后分别涂布于 SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培 养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Xhh;而 亲株1白腐真菌细胞 和 亲株2土著细菌XZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长;第二次融合：上 次得到的等量的Xhh和 亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、在聚乙二醇(PEG， MW=6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含 蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培 养基上，同时能在SIM1、SIM2、SIM3三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融 合的产物NJU-Xhhh1或Xhhh。
其中：白腐真菌PC[真核细胞]、土著菌XZ1[原核细胞]、酿酒酵母SC[真 核细胞]。
SIM1=SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm);
SIM2=SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt);
SIM3=SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。
制备NJU-Xhhh1工程菌剂的液体培养基：1000ml中：K2HPO4 3g;KH2PO4 1g;NH4NO3 0.5g;Na2SO4 0.1g;MgSO4·7H2O 10mg;MnSO4·4H2O 1mg;CaCl2 0.5mg; FeSO4·7H2O 1mg;CH3COONa 5g;酵母浸膏5g;蛋白胨10g;葡萄糖10g;200g 马铃薯浸出汁，调pH至7.0;121℃、103kPa、湿热灭菌20min。最适培养温度： 35±2℃;最适pH：7.0。
制备NJU-Xhhh1工程菌剂的发酵工艺：
发酵设备：全自控生物反应器;
发酵工艺：连续稳定发酵系统;发酵温度，33±2℃;pH值，7.0±1;反应 器中溶解氧，≥2mg/L;，矿物盐流量，0.001-0.005V/(V.d);菌体浓度， 2-10g/L;在含C、P、N培养液中培养。