申请日2005.09.19
公开(公告)日2006.05.17
IPC分类号A01N63/02; C12N1/20
摘要
本发明是一种利用城市生活污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，是一项利用废弃物生产高效生物农药的技术。用含固率为1.5%～5%的污水污泥作为发酵苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)的原料。将污泥装入发酵罐中，pH调节至7.2，经121℃，20min灭菌后，按1%～4%(w/w)的比例接入B.t液体种子，于28℃，200r/m条件下，好气发酵30h后放罐。B.t细胞总数达109个/mL，其中芽孢占90%以上。污泥含有丰富的有机碳、氮和无机盐，是苏云金杆菌Bacillusthringiensis(B.t)生长发育的良好介质，用污水污泥发酵苏云金杆菌比用常规黄豆粉培养基发酵周期约缩短10小时，污泥发酵生产的B.t孢晶混合液比用常规黄豆粉发酵生产的B.t孢晶混合液生物毒性高，成本仅及常规发酵的1/3。因此，用生活污泥发酵生产苏云金杆菌，是一种低成本高效的生产方法。
权利要求书
1、一种利用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法。其特征在于，包括如 下步骤：
(1)苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)种子扩大培养：从斜面上取一环B.t 的菌苔，接种到100mL灭菌的细菌液体培养基(g/L)中(牛肉膏5，蛋白 胨10，NaCl 5，pH=7.2)，置28℃，转速180r/m的摇床上培养12h，做液体 种子。
(2)以污水污泥为原料发酵生产B.t：用含固率1.5%～5%的城市生活污泥作原料， 发酵罐的装料系数为70%，调节pH=7.2，121℃，20min灭菌后，按1%～ 4%(w/w)的比例接入苏云金杆菌液体种子，发酵条件：温度28℃，转速 200r/m，好气发酵30h后放罐(此时活菌数达109个/mL，其中芽孢占90 %以上)。
2、根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特 征在于权利要求1中所述的污水污泥是指城市市政污水处理厂或工矿企业内部 污水处理厂(站)经过污水二级生化处理工艺后的剩余污泥，包括经过消化的 和未消化的，含固率为1.5%～5%的污泥。
3、根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特 征在于苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)种子扩大培养采用细菌液体培养基 培养，配方为(g/L)牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH=7.2。
4、根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特 征在于用发酵罐发酵生产B.t是指用含固率1.5%～5%的污水污泥(pH=7.2)作 原料，在通用式发酵罐中发酵生产B.t菌液，污水污泥经灭菌后，按1%～4% (w/w)接入苏云金杆菌液体种子，28℃，搅拌转速200r/m，通气发酵30h放 罐。
5、根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特 征在于调节细菌培养基和污水污泥pH到7.2是指采用稀酸(HCl或H2SO4)或 稀碱(NaOH)调节。
说明书
一种利用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法
一、技术领域
本发明涉及一种用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，是一项利用 废弃物生产高效生物农药的技术，属于环境生物技术领域。
二、技术背景
我国多数污水处理厂采用活性污泥法进行污水净化，在净化污水的同时会产生 占污水进水量约0.3-0.7%的污水污泥。这些数量日益庞大而且高度集中的废弃物的 无合适的处置出路，已成为严重困扰着我国污水处理事业的健康发展的重要因素之 一。
另一方面，目前使用化学农药防治植物病虫害对农业增产起到重要的作用，但 是化学农药的残留对环境和人畜健康都有很大危害。大力发展对人畜无害的生物农 药是现代农业特别是有机农业和无公害农业的迫切要求。苏云金杆菌是迄今世界上 应用最为广泛也最为成功的生物农药，苏云金杆菌在发育过程中其细胞的一端会形 成折光而不易着色的椭圆形芽孢，同时在细胞的另一端形成菱形或近正方形的伴孢 晶，随后芽孢和伴孢晶体从细胞中脱落进入发酵介质中。伴孢晶体是一种蛋白质毒 素(又称δ-内毒素)，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目等昆虫有显著的杀虫毒 性，用于防治粮食作物、蔬菜、棉花、果树等多种害虫。其杀虫机理为：在有害昆 虫的碱性中肠(pH8.9以上)内，蛋白质晶体水解成有毒性的小分子多肽，而毒杀 昆虫。由于动物的消化道呈酸性，缺乏使晶体水解的条件，故对人畜无毒。然而， 目前苏云金杆菌制剂的生产多以黄豆粉，淀粉，酵母膏等价格较高的农副产品为原 料，生产成本较高，限制了苏云金杆菌制剂的进一步推广，据报道苏云金杆菌生产 原料占整个生产成本的30～40%，因此，选择低成本的原料是苏云金杆菌制剂商业 化生产的关键。
以采用生化二级处理工艺(如活性污泥法)处理生活污水的城市污水处理厂或 一些食品加工企业的污水处理厂产生的污水污泥含有丰富的有机碳、氮和无机盐， 其中有害物质主要是重金属含量远远底于农用污泥污染物控制标准，用其作原料发 酵B.t作为生物农药，既可为生物农药苏云金杆菌的生产提供一种低成本的生产方 法，又将污水污泥开发成高价值的生物产品，对解决污水污泥处置出路有重要的意 义。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法， 苏云金杆菌制剂传统的发酵生产多用黄豆粉，淀粉，酵母膏等农副产品，成本较高， 限制了苏云金杆菌制剂的大范围推广应用。污水处理厂产生的废弃物——污泥含有 丰富的有机碳、氮和无机盐，用于发酵生产苏云金杆菌成本低廉，药效可靠，利于 苏云金杆菌的大范围推广应用。
技术方案
用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法：
1、苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)546，南京农业大学资环学院环境微 生物实验室分离保存。
2、B.t种子扩大培养：从斜面上取一环B.t的菌苔，接种到100mL灭菌的细菌 液体培养基(g/L)中(牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH=7.2)，置28℃， 转速180r/m的摇床上培养12h，做液体种子。
3、发酵罐发酵生产B.t：用含固率1.5%～5%的污水污泥(pH用稀HCl或H2SO4 或稀NaOH调节至7.2)作原料，在通用式发酵罐中发酵生产B.t菌液，污 水污泥经灭菌后，接入1%～4%的B.t种子菌液，28℃，搅拌转速200r/m， 通气发酵30h放罐。
4、经检验，活菌数达109个/mL，其中芽孢占90%以上。生产出的苏云金杆菌 的液体制剂与用黄豆粉等工业发酵用培养基生产出的液体制剂，B.t活菌数 及活芽孢数量相当，其生物毒性前者略高于后者。
有益效果：
本发明提供的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，具有以下有益 效果：
1、本发明提供的生产原料是污水处理过程中产生的废弃物——污泥，污泥量 大易得，几乎不需成本。
2、以处理生活污水或食品加工业废水为主的污水处理厂所产生的污水污泥含 有丰富的有机碳、氮和无机盐，有害物质(主要是重金属)含量少，可完全满足苏 云金杆菌发酵生产的营养需求。
3、将污水污泥开发成有价值的生物制品，有利于解决污水污泥处置出路，对 保护环境有重要意义