申请日2007.10.11
公开(公告)日2009.07.08
IPC分类号C02F9/02; C02F1/50; C02F1/28; C02F1/38; C02F1/52
摘要
本发明公开了一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法。该病毒浓集的方法，包括以下步骤：1)调节水样条件：取污水或污水处理厂尾水水样，加入Al3+，使Al3+终浓度为0.5-1mol/L，将pH值调节至3.0-3.5;2)吸附：在步骤1)的水样中，加入硅胶颗粒，搅拌吸附;3)洗脱：收集步骤2)吸附后的硅胶，用pH 3.0-3.5H2SO4溶液冲洗后，放入pH值为9.0-9.5的尿素-赖氨酸缓冲液中振荡涡漩，离心收集上清液得到洗脱液;4)洗脱液浓缩：将步骤3)得到的洗脱液超滤浓缩。本发明的方法不仅具有回收率相对较高、处理水量大、效果稳定、操作简单、成本低廉等优点，还可以将浓集后的样品直接用于分子生物学操作，为快速准确检测水环境中的病毒提供了强有力的技术支持。
权利要求书
1、一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法，包括以下步骤：
1)调节水样条件：取污水或污水处理厂尾水水样，加入Al3+，使Al3+终浓度为 0.5—1mmol/L，将pH值调节至3.0—3.5;
2)吸附：在步骤1)的水样中，加入硅胶颗粒，搅拌吸附5-10分钟或10-20分 钟;其中硅胶颗粒的添加量为1—4g/L污水或污水处理厂尾水;
3)洗脱：收集步骤2)吸附后的硅胶，用pH值为3.0—3.5的H2SO4溶液冲洗后， 放入pH值为9.0—9.5的尿素-赖氨酸缓冲液中振荡涡漩20-30分钟，离心收集上清 液得到洗脱液;所述尿素-赖氨酸缓冲液的组成是：1.5M尿素，0.02M赖氨酸和 0.008M NaH2PO4;所述H2SO4溶液的用量为10—20ml/g硅胶颗粒;所述尿素-赖氨酸 缓冲液的用量为20—30ml/g硅胶颗粒;
4)洗脱液浓缩：将步骤3)得到的洗脱液超滤浓缩得到浓缩了病毒的污水样品。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，Al3+终浓度为 1mol/L，所述Al3+是通过AlCl3加入的。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，将污水或污水 处理厂尾水的pH值调节至3.0。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述硅胶颗粒 的粒径为200目，所述硅胶颗粒的添加量为1g/L污水或污水处理厂尾水。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，收集步骤2) 吸附后的硅胶是用滤纸过滤收集;所述尿素-赖氨酸缓冲液的pH值为9.0;所述冲 洗用H2SO4溶液的pH值为3.0。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述滤纸为定性滤纸。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中还包括在洗脱液 超滤前先每50ml尿素-赖氨酸缓冲液加入1ml50×TE缓冲液，并调水样pH为7.0。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，超滤后每1L 污水或污水处理厂尾水水样浓缩至0.1—1.5ml。
9、根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于：当所述污水为生活 污水时，所述步骤1)中，还包括将所述污水在调节水样前进行过滤。
说明书
一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法。
背景技术
通过水传播的病原微生物是危害人类健康和生态安全的重大隐患，全世界约有 1/4的疾病是由水中病原微生物直接或间接引起的(Gerba，C.P.，Pathogens in the environment.In：Pepper，I.L.，Gerba，C.P.，Brusseau，M.L.(Eds.)，Pollution Science.Academic Press，New York，1996.p.279-299)。水环境中的病原微生 物主要分为致病细菌、病毒和原生动物三类，其中病毒在水环境中含量低，但是致 病性强且种类繁多。水环境中的病毒主要来自人和动物的排泄物，这些病毒进入水 环境中后，在相当长的时间里仍保持较高的传染性和致病性，常规的水处理和消毒 工艺不能完全将其去除和灭活(Hambidge，A.，Reviewing efficacy of alternative water treatment techniques.Health Estate 2001.55(6)，23-25)，已有众多 研究者在污水(Baggi，F.，Peduzzi，R.，2000.Genotyping of rotaviruses in environmental water and stool samples in Southern Switzerland by nucleotide sequence analysis of 189 base pairs at the 5_end of the VP7 gene.J.Clin. Microbiol.38，3681-3685)、地表水(Eiji Haramoto，Hiroyuki Katayama，Kumiko Oguma，and Shinichiro Ohgaki Application of Cation-Coated Filter Method to Detection of Noroviruses，Enteroviruses，Adenoviruses，and Torque Teno Virusesin the Tamagawa River in Japan.Applied and Environmental Microbiology，May 2005，p.2403-2411)、地下水以及饮用水(Gratacap-Cavallier， B.，Genoulaz，O.，Brengel-Pesce，K.，Soule，H.，Innocenti-Francillard，P.， Bost，M.，Gofti，L.，Zmirou，D.，Seigneurin，J.M.，2000.Detection of human and animal rotavirus sequences in drinking water.Appl.Environ.Microbiol. 66，2690-2692)中检测出轮状病毒、诺瓦克病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、腺 病毒等。Sobey等人的报告中指出，城市生活污水造成的地下水污染已经使污水中 的病原微生物成为公众健康的威胁。在1989-1990年间，美国爆发的26起通过饮用 水传播的流行疾病就有13起由此而引起(J.E.Scandura，M.D.Sobey.Viral and bacterial contamination of groundwater from on-site sewage treatment systems. Water Science and Technology，1997，35(11-12)：141-146.)。也有研究也表明， 经用于灌溉或直接排入地表水系统的再生水也存在病毒污染的风险(Ganoulis， Anastasia Papalopoulou.Risk analysis of wastewater reclamation and reuse. Wat.Sci.Tech.1996(33)，297-302.)。因此，快速及时地检测水环境中病毒污染 状况，及时发现水处理工艺中的失误，分析病毒传播途径，并制定高效的预防控制 手段，这对于降低轮状病毒感染风险、预防控制轮状病毒疾病爆发流行、保障水质 安全具有十分重要的意义。
病毒检测系统由浓集水样和检测浓缩后水样中的病毒两个部分组成。由于水中 病毒的浓度非常低，不能直接检出，而且环境中存在大量干扰细胞感染及分子生物 学检测的杂质，因此病毒检测的主要难点之一就是从大体积水样中高效地浓集出目 标病毒并去除浓缩病毒的同时也被浓缩的干扰物质。
目前，研究较多、应用较广泛的病毒浓集方法有以下几种：
1.吸附-洗脱法
吸附-洗脱法是让病毒吸附在滤材表面，然后用洗脱液将病毒从滤材上洗脱下 来。常用的滤材有带负电和带正电的两种，常用的吸附介质一般是滤膜或固体颗粒。 常用的洗脱液根据作用方式不同有两类：一类是改变吸附特性的物质，如甘氨酸、 三氯乙酸及EDTA等;另一类是和病毒竞争吸附位点的蛋白类物质，如牛肉提取液 (Beef Extract)等。
2.絮凝沉淀法
絮凝沉淀法，即向水中加入化学物质，形成絮凝沉淀，病毒通过与沉淀结合而 浓缩。常用的无机絮凝剂有氢氧化铝、氯化铝、磷酸铝、磷酸钙;有机絮凝剂有聚 乙二醇和鱼精蛋白的硫酸盐等。絮凝法浓集大体积水样中的病毒效率不高，一般用 于小体积的水样浓缩，如吸附法的洗脱液中病毒的再浓缩。
3.免疫捕获法
免疫捕获法是基于抗体和抗原特异性结合的原理。将高特异性的纯化抗体交联 于层析材料上，装填成柱，或具有超顺磁性的氧化铁粒子连接上抗体，抗体与样品 液中对应的致病微生物发生特异性结合，在外加磁场的作用下，载有致病微生物的 免疫磁性粒子向磁极方向聚集，收集磁粒子，最后用洗脱液洗脱层析材料或磁粒即 可得到浓集后的病毒(Casas N，Sunen E..Detection of enteroviruses，hepatitis A virus and rotaviruses in sewage by means of an immunomagnetic capture reverse transcription PCR assay[J].Microbiol Res，2002，157(3)：169-175.)。 这种结合过程是特异的，能有效去除各种干扰物质，灵敏度极高，操作相对简单。 而且具有良好的兼容性，可以很容易与各种检测方法相结合。有研究者把免疫磁珠 分离技术(immunomagnetic bead-based separation，IMS)与PCR技术结合在一起， 发展了IMS-PCR技术，提高了PCR检测的效率和准确性。吸附免疫捕获技术的难点 是制备高性能的固相载体和病原微生物的特异性抗体，如制备均一球形超顺磁性且 易于结合蛋白的磁珠，在国外多为专利产品且价格昂贵，国内对免疫磁珠技术的研 究刚刚起步。
4.电阻拦法
当含微生物的液体流经垂直电场内的填充层时，被极化的填充料阻拦了微生物 以及其它可形成溶液的物质(如核酸、蛋白质、甚至分子量比较低的有机物)。填充 料对很小的颗粒来说不是真正的过滤层，即使最好的微生物吸附剂，它的吸附容量 不大，只因为放到了电场中，才转变成高效率的过滤器，吸附容量增大几十个数量 级。填充料上阻留的微生物等在切断电场后，很容易用水流冲洗下来(丁昌慧，邵 荣标。水中脊髓灰质炎病毒浓集方法研究的新进展。中国卫生检验杂志，2000， 10(4)：509-510.)。
水中理想的浓集方法应该具备：(1)效果稳定，回收率高，能检测大体积水样 中微量的病毒;(2)操作简单，成本较低，能用于常规水质监测。尽管目前可用的 浓集方法有很多种，且各有所长，但实际水体中复杂的水质条件，使病毒浓集效果 受到影响，为了能更好地应用于水质安全管理，仍然需要进一步探索。
相较饮用水而言，城市生活污水和污水厂尾水水质条件复杂，有机物含量高， 利用滤膜法容易堵塞。
发明内容
本发明的目的是提供一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法。
本发明所提供的浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法，包括以下步骤：
1)调节水样条件：取污水或污水处理厂尾水水样，加入Al3+，使Al3+终浓度为 0.5-1mmol/L，将pH值调节至3.0-3.5;
2)吸附：在步骤1)的水样中，加入硅胶颗粒，搅拌吸附;
3)洗脱：收集步骤2)吸附后的硅胶，用pH3.0-3.5的H2SO4溶液冲洗后，放入 pH值为9.0-9.5的尿素-赖氨酸缓冲液中振荡涡漩，离心收集上清液得到洗脱液;
4)洗脱液浓缩：将步骤3)得到的洗脱液超滤浓缩。
所述方法中，所述步骤1)中，Al3+终浓度优选为1mol/L，所述Al3+优选为是 通过AlCl3加入的。
所述方法中，所述步骤1)中，将pH值调节至3.0-3.5。
所述方法中，所述步骤2)中，所述硅胶颗粒的粒径为200目，所述硅胶颗粒 的添加量可为1—4g/L污水或污水处理厂尾水，优选为1g/L污水或污水处理厂尾 水。
所述方法中，所述步骤2)中，所述搅拌吸附的时间为10-20分钟。
所述方法中，所述步骤3)中，收集步骤2)吸附后的硅胶是用滤纸过滤收集， 所述滤纸优选为定性滤纸;所述尿素-赖氨酸缓冲液为的pH值优选为9.0;所述冲 洗用H2SO4溶液pH值优选为3.0，所述H2SO4溶液的用量为10—20ml/g硅胶颗粒。
所述方法中，所述步骤3)中，尿素-赖氨酸缓冲液的用量为20—30ml/g硅胶 颗粒;所述振荡涡漩的时间为20-30分钟。
所述方法中，所述步骤4)中还包括在洗脱液超滤前先每50ml尿素-赖氨酸缓 冲液加入1ml 50×TE缓冲液，并调水样pH为7.0。
所述方法中，所述步骤4)中，所述超滤后每1L污水或污水处理厂尾水水样浓 缩至0.1—1.5ml。
上述污水处理厂尾水，包括污水处理后的各种出水(如二级处理出水、三级处 理出水(一般也称为再生水)等)也可为其他污水如地表水、景观娱乐用水等。
本发明的方法针对浊度较高、杂质较多的生活污水和污水处理厂尾水，通过向 水环境样品中投加多价阳离子和固体颗粒荷电材料吸附水中病毒，收集固体颗粒后 利用尿素-赖氨酸溶液洗脱其吸附的病毒，建立了固体颗粒(硅胶)吸附一尿素-赖 氨酸溶液洗脱的浓集方法，可在1-2小时内得到浓集病毒的水样，即省时间又减少 了长时间操作造成的病毒死亡，生活污水回收率平均为21%，污水厂尾水回收率平 均为27%，与目前同类的研究相比具有较好的回收效率。该方法不仅可以处理大体 积高浊度水环境样品，还避免使用牛肉提取液(含有较多干扰分子生物学操作的杂 质)洗脱吸附病毒，利用该方法浓集后的样品，不仅可以直接利用传统的细胞培养 法检测，还可以直接利用分子生物学方法检测。
本发明的方法具有回收率相对较高、处理水量大、效果稳定、操作简单、成本 低廉、应用广泛等优点，在污水及污水处理尾水、再生水、景观娱乐用水等水环境 病毒检测中有广阔的应用前景。