申请日2010.12.01
公开(公告)日2011.03.30
IPC分类号C12Q1/68; C12Q1/06; C12Q1/10
摘要
一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法，属于生物技术中病原菌检测技术领域。本发明依次包括以下步骤：(1)污泥样品的梯度稀释及前增菌培养;(2)选择性增菌培养;(3)DNA提取;(4)PCR扩增及扩增产物检测;(5)利用MPN计数软件计算得出结果。本发明采用MPN法和特异性PCR检测相结合的方法，实现了污泥中志贺氏菌的快速定量检测，选择性增菌和特异性PCR能避免其他微生物的干扰，提高检测的灵敏度和特异性。本发明还具有缩短检测时间、提高检测效率和增大检测样品量的优点。
权利要求书
1.一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法，其特征在于检测步骤如下：
(1)污泥样品的梯度稀释和前增菌培养：取城市剩余污泥样品混匀，称取3g城市剩余污泥到盛有27mL GN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5-10min，混合均匀得泥水混合物;取0.5mL GN增菌液稀释混匀的泥水混合物加入到经过灭菌的4.5mL GN增菌液中得到各个稀释梯度，设5-7个稀释度;采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3-5个重复样，于37℃培养18-24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液;
(2)选择性增菌培养：移取步骤(1)所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养18-24h;
(3)DNA提取：移取步骤(2)所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3 min，弃去上清液;再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3 min，弃去上清液;加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取;提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间-20℃保存;
(4)PCR扩增及扩增产物检测：PCR为50μL反应体系：取步骤(3)所得DNA 模板1μL，含MgCl2的10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L的dNTPs 4.0μL，均为20mmol/L的引物P1、P2各0.5μL，5U/μL的rTaq酶0.25μL，加入灭菌双蒸水至50μL;PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，经30个循环;最后72℃延伸10min;
延伸后的扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行拍照，产生特异性扩增条带的即为阳性，不产生特异性条带的即为阴性;
所述特异性引物为：
P1：5’-CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC-3’;
P2：5’-CTCATACTTCTGCTCTTCTGCC-3’;
(5)用MPN计数软件计算结果：根据凝胶成像系统拍照结果，确定最大或然数MPN结果，用MPN Calculator软件计算得出污泥中最大可能的志贺氏菌含量。
说明书
一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法
技术领域
本发明公开了一种针对污泥环境中志贺氏菌的快速定量检测方法，属于生物技术中病原菌检测技术领域。
背景技术
志贺氏菌属(Shigella)细菌通称痢疾杆菌，在引发我国感染性腹泻病的各原菌所占比例中居首位，是一类具有高度感染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌。每年全球有1.6亿人因此菌感染患病，约有110万人死亡，绝大多数为5岁以下儿童。由于生活污水中含有许多病原微生物，例如来自肠道的细菌、病毒、原生动物、寄生虫等，这些微生物绝大部分都将随污水处理进入剩余污泥，在污泥的农业土地利用过程中，通过污染地表水、地下水、形成气溶胶等多种途径而扩散到环境中。这些随污泥进入环境中的病原微生物对人体健康和环境安全造成了巨大的潜在威胁，因此，准确快速地检测污泥中的志贺氏菌，对防止志贺氏菌传播扩散具有十分重要的意义。
志贺氏菌的检测通常采用食品卫生微生物学检验国家标准(GB4789.5–2003)，即利用鉴别培养基结合生理生化鉴定。但这种方法应用于污泥样品检测时，一方面由于污泥组成复杂、含有大量微生物而对检测的灵敏度产生干扰，另一方面存在检测周期长、漏检率高、程序复杂、所需试剂繁多等缺点。目前也有其他专利报道了志贺氏菌的检测方法，例如华南农业大学发明的一种志贺氏菌的检测用引物及检测方法(CN101845493A)和曹际娟发明的饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法(CN101624624A)，但是均不能满足污泥样品中志贺氏菌快速定量检测的要求。
本发明通过MPN方法结合特异性PCR检测志贺氏菌。MPN计数是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量(如l mL)的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度(即临界级数)中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
以往研究者往往通过相应稀释法测数统计表(如GB/T 4789.38-2008中用MPN计数大肠杆菌数量使用了大肠杆菌MPN检索表)查得细菌近似值。而本发明应用了MPN Calculator 软件，一方面应用此软件使得计数更为简单方便，另一方面MPN检索表只限于3-4个稀释度，而MPN Calculator软件能达到7个稀释度，且稀释度选择并不需要像MPN检索表那样标准化，每个稀释度下的重复管数也可以不同。
发明内容
本发明的目的：本发明的目的是提供一种能够快速定量检测污泥中志贺氏菌的方法，满足污泥样品中志贺氏菌快速定量检测的要求。
本发明的技术方案：一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法，检测步骤如下;
(1)污泥样品的梯度稀释和前增菌培养：取城市剩余污泥样品混匀，称取3g城市剩余污泥到盛有27mL GN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5-10min，混合均匀得泥水混合物;取0.5mL GN增菌液稀释混匀的泥水混合物加入到经过灭菌的4.5mL GN增菌液中得到各个稀释梯度，设5-7个稀释度;采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3-5个重复样，于37℃培养18-24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液。
(2)选择性增菌培养：移取步骤(1)所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养18-24h。
(3)DNA提取：移取步骤(2)所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3 min，弃去上清液;再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3 min，弃去上清液;加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取;提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间-20℃保存。
(4)PCR扩增及扩增产物检测：PCR为50μL反应体系：取步骤(3)所得DNA模板 1μL，含MgCl2的10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L的dNTPs 4.0μL，均为20mmol/L的引物P1、P2各0.5μL，5U/μL的rTaq酶0.25μL，加入灭菌双蒸水至50μL;PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，经30个循环;最后72℃延伸10min。
延伸后的扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行拍照，产生特异性扩增条带的即为阳性，不产生特异性条带的即为阴性。
所述特异性引物为：
P1：5’-CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC-3’;
P2：5’-CTCATACTTCTGCTCTTCTGCC-3’。
(5)用MPN计数软件计算结果：根据凝胶成像系统拍照结果，确定最大或然数MPN结果，用MPN Calculator软件计算得出污泥中最大可能的志贺氏菌含量。
所述GN增菌液的配置：配方为胰蛋白胨 20.0g，葡萄糖 1.0g，甘露醇 2.0 g，柠檬酸钠 5.0g，去氧胆酸钠 0.5 g，磷酸氢二钾 4.0 g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钠 5.0 g，蒸馏水定容至1000mL。按上述成分配置溶液，加热使其溶解，调整pH7.0，115℃高压灭菌15min。
所述志贺氏菌增菌肉汤的配置：配方为胰蛋白胨 20.0g;磷酸氢二钾 2.0g;磷酸二氢钾 2.0 g;氯化钠 5.0 g;葡萄糖1.0 g;吐温80 1.5 g。按上述配方混合均匀，加热溶解于蒸馏水中定容1000mL，调整pH7.0，121℃高压灭菌15min，冷至50-55℃时，每225mL培养基中加入1支无菌新生霉素溶液(含新生霉素125g)，混匀。
本发明的有益效果：本发明所提供的检测方法能克服传统的微生物培养检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点，使检测时间大大缩短到2-3天，操作步骤和劳动强度也大为缩减，达到省时省力、快速灵敏的要求。本发明通过MPN方法结合特异性PCR检测，既实现了污泥样品中志贺氏菌定量检测的需要，采用选择性增菌培养和特异性PCR检测的方法，避免了其他微生物的干扰，提高了检测的灵敏度和特异性。本发明为制定和改进城市剩余污泥处理处置以及应用标准等方面具有重要的理论价值和实际指导意义。