申请日2009.04.27
公开(公告)日2009.09.30
IPC分类号C02F3/12; C12N15/02; C12R1/00
摘要
本发明公开了一种基于基因强化的好氧颗粒污泥功能定向构建与调控新方法，它是以携带可移动功能基因片断的微生物为供体菌，培养至成熟或半成熟状态的好氧颗粒污泥为受体菌，通过供/受体菌在系统外杂交(异位杂交)或系统内直接杂交(原位杂交)，使好氧颗粒污泥中的固有微生物因接受可移动功能基因片断而产生特殊降解功能;通过对杂交后的颗粒污泥强化培养，可获得具有稳定结构和特殊降解功能的好氧颗粒污泥。与传统的通过驯化获取功能化的颗粒污泥方式相比，具有简单、快捷、高效等优点。
权利要求书
1.一种基于基因强化的好氧颗粒污泥 功能定向构建与调控新方法，其特征在于：
以携带可移动功能基因片断的微生物为供体菌，培养至成熟或半成熟状态的好氧颗粒污 泥为受体菌，通过供/受体菌在系统外杂交(异位杂交)或系统内直接杂交(原位杂交)，使 好氧颗粒污泥中的固有微生物因接受可移动功能基因片断而产生特殊降解功能;通过对杂交 后的颗粒污泥强化培养，可获得具有稳定结构和特殊降解功能的好氧颗粒污泥。
2.根据权利要求1所述的可移动功能基因片断，包括质粒、转座元件及其它可移动功能基因 片断;
3.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥，是指以任何基质培养至成熟或半成熟状态的好氧颗 粒污泥;
4.根据权利要求1所述的系统外杂交(异位杂交)，是将颗粒污泥从反应器中取出后与基因 供体菌进行杂交，基因供体菌与颗粒污泥按照质量比1/10—1/2混合，在20℃—35℃，100— 250转/分钟下杂交反应5—16h;在杂交过程中需要向杂交体系补充一定量碳、氮和磷源，施 加一定量的目标污染物作为选择压力。
5.根据权利要求1所述的系统内杂交(原位杂交)，是将基因供体菌直接投加到颗粒污泥培 养反应器内进行杂交，原位杂交时供/受体菌的投加比率为1/10—1/1，杂交时间5—24h。在 杂交过程中需要向杂交体系补充一定量碳、氮和磷源，施加一定量的目标污染物作为选择压 力。
6.根据权利要求1所述杂交后颗粒的强化培养，是用目标污染物及易降解碳源组成的混合基 质废水强化培养5—30天，其中半成熟颗粒需10—30天，成熟颗粒5—15天，即可获得具有 目标功能的好氧颗粒污泥。
说明书
一种好氧颗粒污泥功能定向构建与调控的新方法
所属技术领域
本发明涉及一种利用基因强化进行好氧颗粒污泥功能定向构建与调控的新方法，属于环 境保护与资源综合—水污染防治领域。
背景技术
颗粒污泥是多种微生物形成的聚集体，它以生物密度高、代谢活性强、沉降性好、抗有 毒有害物质负荷冲击能力强而受到国内外环境保护研究人员的普遍关注。颗粒污泥分为厌氧 颗粒污泥和好氧颗粒污泥。人类对厌氧颗粒污泥的认识和研究比较早，应用比较成熟，而对 好氧颗粒污泥培育及应用技术的研究方兴未艾。目前，国内外研究中所获得的好氧颗粒污泥 主要是以实验室模拟废水通过长期培养得到，模拟废水普遍采用葡萄糖、乙酸盐、乙醇、蔗 糖等相对比较简单且容易被微生物利用的物质作为基质，在这种条件下所获得的好氧颗粒污 泥虽然在去除一般有机物、脱氮除磷方面显示出良好特性，但很难应用到有毒有害特殊污染 物的去除方面，而以这类物质为目标进行好氧颗粒培养的研究也较少。有目的地对好氧颗粒 污泥功能进行定向构建或调控，将好氧颗粒污泥技术应用到难降解有机污染物治理领域，对 于丰富难降解有机污染物去除技术、推动好氧颗粒污泥技术的环境工程应用具有重要的理论 价值和实践意义。
在特殊功能好氧颗粒污泥培养方面，国内外目前采用的主要方法还是驯化培养法。通过对 易降解基质培养出的好氧颗粒污泥以难降解有机物逐步驯化，或通过易降解有机物与难降解 有机物共基质培养来获取对难降解污染物具有强降解能力的好氧颗粒污泥。Tay et al(2005) 利用以乙酸为基质培养得到的颗粒污泥作为种泥，进行苯酚降解颗粒污泥的培养，并在1周内 培养出苯酚降解颗粒污泥。Wang et al(2008)在间歇培养反应器中以葡萄糖作为主要基质， 并通过逐步提高进水2，4-二氯酚浓度(2，4-DCP)，39d后得到了对2，4-DCP就有优良作用的好氧 颗粒污泥。Adav et al(2007)以500mg/l苯酚为基质，培育出了能够降解浓度为250-2500mg/l 吡啶的好氧颗粒污泥。通过荧光染色和激光共聚焦扫描显微镜分析，发现活性细胞主要集中 在颗粒污泥的外层。驯化培养虽然是对好氧颗粒污泥功能构建与调控的重要手段，但这种方 法具有培养时间长、难度大等缺点。
生物强化技术的发展为好氧颗粒污泥功能构建及调控研究提供了新思路、新方法。生物 强化(Bioaugmentation)是通过投加具有特殊功能的微生物，对目标系统菌群结构进行调控 以达到污染治理或系统改善的目的。从发生机制上分，生物强化可分为细胞强化(Cell augmentation)和基因强化(Gene-augmentation)。细胞强化是利用微生物细胞本身的代谢功 能对环境污染物直接进行分解，基因强化则是向系统中引入编码特殊降解功能的可移动基因 片断(Mobile genetic elements，MGEs)，通过基因片断在微生物细胞间的水平转移和扩散，使 固有菌群获得特殊降解功能，进而分解目标污染物。生物强化技术以其针对性强、见效快、 操作简单而在难降解有机污染物治理中显示出独特的优越性和广泛的应用前景，受到国内外 环境研究人员的普遍关注。相比细胞强化，基因强化对强化菌剂的环境适应性要求较低，是 对系统中固有微生物进行基因修饰的重要方法，在菌群功能调控方面显示出重要的潜力。
目前利用MGEs进行基因强化的研究多集中在污染土壤和废水处理系统中难降解污染物的 去除方面(Top et al，2002)。有研究表明，生物膜作为微生物聚集体，以其浓度高、活性强，而 成为基因水平转移发生的热点场所(Molin et al.，2003)。颗粒污泥作为另外一种形式的微生物 聚集体，必然也会是基因水平转移发生的热点。但目前国内外利用基因强化进行颗粒污泥功 能构建和调控的研究报导仅有一则。Yarlagadda et al(2008)首次报导了利用携带质粒TOL的 Pseudomonas putida KT2442菌作为基因强化的供体菌，对好氧颗粒污泥进行功能调控，并通 过GFP和DsRed报告基因对供体菌在颗粒污泥上的附着及质粒的水平转移进行监测，发现随着 质粒转移的发生，系统对目标污染物苯甲醇的降解能力大大提高。但该报道侧重于强化效果 的描述，对具体方法并未做更多探索。MGEs在微生物细胞间的基因水平转移是一个复杂的过 程，受到很多因素的影响，如供/受体细胞的种属、密度、生长状态及营养水平、接触时间、 离子浓度、选择压力、环境条件(如温度、pH和溶解氧)等。如何通过条件与参数优化实现 可移动基因片断在好氧颗粒污泥中的高效转移?如何从实际应用角度出发，建立基于基因强 化的简便、高效、可操作性强的好氧颗粒污泥功能构建与调控方法?如何使基因强化调控的 好氧颗粒功能得到稳定保持?这些问题尚未得到有效解决。
鉴于传统好氧颗粒污泥功能调控方法存在的不足，我们将研究一种基于基因强化的好氧颗 粒污泥功能构建与调控方法，该方法利用可移动功能基因片断的水平转移对培养至成熟或半 成熟状态的颗粒污泥进行功能调控，再通过强化培养获得具有特殊功能的颗粒污泥，是一种 简便、快捷、高效的好氧颗粒污泥功能构建与调控方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种好氧颗粒污泥功能定向构建与调控的新方法，它将基因强化 技术与污泥颗粒化培养技术相结合，克服了利用传统的驯化培养法培育颗粒污泥所具有的时 间长、颗粒不稳定的特点，对于推动好氧颗粒污泥技术在难降解有机物去除及更多领域的应 用具有重要的理论价值和实践意义。
本发明解决其技术问题所采用的方案是：以携带可移动功能基因片断(MGEs)的微生物 作为供体菌，以半成熟或成熟的颗粒污泥为受体菌，对供/受体菌进行系统外杂交(又叫原位 杂交)或系统内杂交(又叫异位杂交)，通过基因水平转移，使好氧颗粒污泥中的微生物因获 得功能基因片断而产生特殊功能。
供体菌携带的可移动功能基因片断包括质粒、转座元件及其它可移动功能基因片断，基 因片断上含有编码目标物降解功能的完整基因簇;颗粒污泥可以是以任何基质培养至成熟或 半成熟状态的颗粒污泥。
基因供体菌与好氧颗粒污泥的杂交方式分为系统外的异位杂交和直接在生物反应器内的 原位杂交两种。采用异位杂交时供/受体菌的投加的质量比为1/10-1/2，杂交时间5-16h; 原位杂交时供/受体菌的投加质量比为1/10-1/1，杂交时间5-24h。
无论采用何种杂交方式，在杂交过程中需要向杂交体系补充一定量碳、氮和磷源，施加 一定量的目标污染物作为选择压力，以维持杂交系统内微生物的基本代谢需求。
对于杂交反应后的好氧颗粒，为巩固和强化其所获得的特殊降解功能，需要用由目标污 染物及易降解碳源组成的混合基质废水在序批式反应器内强化培养5-30天;其中，半成熟 颗粒需要10—30天，成熟颗粒5-15天。
有益效果：
(1)本发明提出了利用携带可移动功能基因片断的基因供体菌与好氧颗粒污泥杂交，进 行颗粒污泥功能定向构建与调控的新方法，与传统的通过驯化获取功能化颗粒污泥 方式相比，具有简单、快捷、高效等优点;
(2)利用本发明提出的方法对好氧颗粒污泥进行功能调控，不仅会使其对目标污染物的 去除功能比调控前高40%—230%，还保持了颗粒污泥良好的沉降性和稳定性。