申请日2009.05.25
公开(公告)日2010.12.01
IPC分类号C12N1/20; C12N15/01; C12R1/01; C02F101/16; C02F3/34
摘要
本发明公开了一种处理含氨废水微生物菌剂及其生产方法，本发明处理含氨废水微生物菌剂主要包括：硝酸菌(Nitrobacter sp)、亚硝酸菌(Nitrosomonassp.)和反硝化菌(Denitrobacter sp.)等3种菌株。菌剂中三种菌株的含量可以根据具体培养条件和产物要求通过定向驯化等方法来调节或者配比。所述的培养方法包括菌源富集、纯化、逐级放大培养。本发明微生物菌剂可以根据废水处理结果进行定向驯化以提高目标菌株的含量，本发明培养方法具有培养效率高，生产量大等优点，适宜于大规模、商品化生产处理含氨废水的复合微生物。得到的微生物菌剂可有效处理低COD、高氨氮废水，如催化剂生产废水等。
权利要求书
1.一种含氨废水处理微生物菌剂，其特征在于：微生物菌剂中含有硝酸菌、亚硝酸菌和反硝化菌，菌剂中三种菌株的含量为：硝酸菌占5～50%，亚硝酸菌占40～90%，反硝化菌占5～50%。
2.按照权利要求1所述的含氨废水处理微生物菌剂，其特征在于：微生物菌剂中含有营养物质和保藏助剂。
3.按照权利要求2所述的含氨废水处理微生物菌剂，其特征在于：所述的营养物质为含有Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+的可溶性铵盐溶液，每升营养物质液中NH4+、Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+这五种阳离子的摩尔配置浓度为(1700-3400)∶(1-8)∶(14-28)∶(15-35)∶(8-40)，单位：mmol/L，加入量为菌体体积的1～5倍。
4.按照权利要求2所述的含氨废水处理微生物菌剂，其特征在于：低温保存使用保藏助剂为防冻剂。
5.按照权利要求4所述的含氨废水处理微生物菌剂，其特征在于：防冻剂为二甲基亚砜，加入量为包装体积的5%～15%。
6.一种权利要求1所述含氨废水处理微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)准备菌源;
(2)提纯步骤(1)所述的菌源，得到纯度提高的菌体;
(3)将步骤(2)纯度提高的菌体进行多级培养，第一级培养采用批次补加铵盐的方式，第二级以上培养均采用批次补料和批次换水交替进行的方式，培养过程中定期补加生长促进剂;
(4)完成多级放大后收集菌体、浓缩、包装并保存备用。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的菌源由含有硝化细菌的基质通过富集培养得到，含有硝化细菌的基质来源于天然的土壤、淤泥或含氨工业废水处理厂的活性污泥。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的提纯方法包括定向驯化、梯度稀释、平板筛选或者紫外线照射。
9.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的多级培养为三级培养。
10.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的定向驯化在高氨氮浓度和高pH值下进行培养，培养过程培养液氨氮初始浓度为100～1000mg/L，最终氨氮浓度为1200～3000mg/L，培养液COD值低于400mg/L，pH值控制为7.5≤pH≤9.5。
11.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的梯度稀释培养过程为以富集培养得到的菌源为基础，在无菌状态下用灭菌的含氨氮浓度100-500mg/L、COD 100mg/L以下的废水进行梯度稀释提纯，每次稀释1～10倍，对每个稀释倍数在无菌状态下培养10～40天，对每个培养液利用格利斯试剂测定是否产生了亚硝酸盐氮，最后一个产生亚硝酸盐氮的培养液被认为其中的亚硝酸菌最初都是从一个母细胞分裂而来，结束提纯过程。
12.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的平板筛选方法为分别从富集培养液中分离出纯度提高的单个菌株，再按照适宜比例组成复合微生物菌群。
13.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的紫外线照射方法为通过紫外照射获得硝化能力强、生长速率快的菌株，过程是将菌源制备成菌悬液置于紫外灯下照射5～15秒钟，将处理后的菌悬液再进行固体平板培养基上培养，获得纯度相对较高、硝化能力较强的菌株。
14.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的三级放大培养过程中，第一级采用5～100L小规模培养反应器，第二级培养反应器规模为第一级培养反应器规模的5～20倍，第三级培养反应器规模为第二级培养反应器规模的10～50倍，三级放大培养过程总用时间一般为3～6周。
15.按照权利要求9或14所述的方法，其特征在于：第一级培养采用在不排水的情况下批次补加铵盐方式，补加铵盐采用适宜浓度的铵盐溶液，当氨氮去除率达到80%以上时，补加氨氮浓度为10-25g/L的铵盐溶液，使得补加铵盐后培养液中的氨氮浓度达到800～1500mg/L;初始反应器内物料为反应器有效容积的20%～60%，当反应器内物料达到反应器有效体积80%以上时终止反应，自然沉降后排出上清液，将菌体转到第二级培养反应器中。
16.按照权利要求15所述的方法，其特征在于：第二级培养和第三级培养采用先批次补加铵盐后批次换水交替进行的方式进行培养，第二级培养的批次补加铵盐和批次换水交替进行1～5次，第三级培养的批次补加铵盐和批次换水交替进行2～6次，第二级培养的初始体积和初始氨氮浓度与第一级培养反应器终止时的体积和氨氮浓度相同，当氨氮去除率达到80%以上时补加铵盐溶液，使得补加铵盐后培养液中的氨氮浓度达500～1500mg/L;当硝化反应产物累计浓度达3000-6000mg/L时，停止曝气待自然沉降后排出上清液，保留菌体，加入与排出液同体积的反应液继续反应，直到反应液体积达到反应器容积的80%以上时将菌体转入下一级进行培养;第三级培养方法与第二级培养方法相同，完成三级放大后结束一个批量的生产过程，收集保藏菌体。
17.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：培养过程中使用的生长促进剂包含Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+这四种金属阳离子，四种金属阳离子的摩尔配置比例为1∶(4-8)∶(5-15)∶(1-5);生长促进剂每12～48小时补加一次。
18.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(4)放大培养的菌体浓缩后得到浓度较高的菌悬液，将这些菌悬液加入营养液或者营养液和保护剂的混合液后可以制备成液态菌剂，或者制备成干粉状的菌剂。
19.按照权利要求18所述的方法，其特征在于：所述的浓缩方法为通过自然沉降、离心或者过滤方法。
说明书
含氨废水处理微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体地说涉及一种污水处理微生物菌剂及其制备方法，该方法可以实现用于含氨废水处理微生物的产业化、商品化。
背景技术
废水生物脱氮包括硝化和反硝化两个过程，其中参与硝化作用的微生物主要是硝化细菌，它是典型的自养细菌，从生物氧化氨氮到硝态氮过程中获得能量，一般以无机碳为碳源，因此代谢时间长、生长比较缓慢，属于革兰氏阴性菌，细胞壁中肽聚糖含量低，蛋白质和脂肪含量高，对环境变化比较敏感，所以自然界中天然的硝化细菌适应性和耐受性比较差。
硝化细菌研究中的种种困难起始于将其从纯培养中分离出来。就是采用严格无机培养的平板法，也并不适于从自然环境中直接将其分离出来，因为即使自接种物中引入的有机物质也能使异养的污染微生物生长。自养硝化细菌最成功的分离是预先采用了一系列广泛而仔细的增富步骤(Belser L.W.and E.L.Schmidt.1978.Diversity in the ammonia-oxidizing nitrifier population of a soil.Appl.Environ.Microbiol.36：584-588)。如同济大学的金志刚等对污泥中硝化细菌富集培养技术进行较详细的研究，结果表明：经过12-13周的富集培养，污泥中硝化细菌浓度可达2.0×108(MPN)/g(MLSS)，是未经富集污泥中硝化细菌浓度的12.5-20倍(金志刚，何群彪.硝化细菌富集技术分析及方法研究.1998，上海环境科学，17(8)：10-19);中国专利CN1354786A中公开了一种硝化细菌的高浓度培养方法;中国专利200710010383.0也公开了一种硝化细菌的富集方法，得到了富含硝化细菌且价格低廉的活性污泥样品。
已有的这些培养技术仅停留在实验室和小规模试验水平，不适于大规模商业生产，所以硝化细菌的产品化、商业化过程一直进展很慢。
中国专利CN1546650A公开了一种高活性、高稳定性液体硝化细菌的规模生产工艺，其特征是在好养发酵器中布置软性纤维;采用含有低分子有机碳源的培养基，促进硝化细菌的附着生长;定期补充低分子有机碳源和氮源，定期洗脱软性纤维上的硝化细菌;用低溶氧、低pH值、密封条件保存收集液;检测后装入包装容器。该液体硝化细菌主要用于生物修复养殖水环境和景观水环境。
目前虽然已有硝化细菌培养方面的一些技术，但规模化生产效率较低，产品价格较昂贵，且只能用于处理低浓度如低于500mg/L的氨氮废水，如中国专利CN1509991A公开的硝化菌剂涉及汉堡硝化杆菌、维氏硝化杆菌和酿酒酵母等六种菌株，这些菌株经培养后按其培养物同等体积比例配比组成耐低温硝化菌剂，在较低温度下具有去除超低浓度氨氮的作用，单独使用或与相应的生物反应器适配，可用于海水养殖和工厂化循环海水高密度养殖的氨氮去除和COD的去除，不适用于处理低COD、高氨氮浓度的工业废水。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种用于低COD、高氨氮废水处理的微生物菌剂及其生产方法，本发明方法具有培养效率高，获得的微生物菌剂可以有效处理很高氨氮浓度的工业废水，如催化剂、合成氨生产废水等。
本发明处理含氨废水微生物菌剂主要包括：硝酸菌(Nitrobacter sp)、亚硝酸菌(Nitrosomonas sp.)反硝化菌(Denitrobacter sp.)等3种菌株。菌剂中三种菌株的含量一般为：硝酸菌占5～50%，亚硝酸菌占40～90%，反硝化菌占5～50%(以各菌株的数量计算)。菌剂中三种菌株的含量可以根据具体培养条件和产物要求通过定向驯化等方法来调节或者配比。微生物菌剂中还可以含有适宜的添加剂，如营养物质、保藏助剂等。
本发明处理含氨废水微生物菌剂的制备方法包括以下内容：包括如下步骤：
(1)准备菌源;
(2)提纯步骤(1)所述的菌源，得到纯度提高的菌体;
(3)将步骤(2)纯度提高的菌体进行多级培养，第一级培养采用批次补加铵盐的方式，第二级以上培养均采用批次补料和批次换水交替进行的方式，培养过程中定期补加生长促进剂;
(4)完成多级放大后收集菌体、浓缩、包装并保存备用。
一种具体过程为：首先准备菌源。通过定向驯化、梯度稀释、平板筛选或者紫外线照射等方法获得纯度较高的菌体。然后将纯度较高的菌体进行多级培养，可以是二级、三级、四级、五级等，从经济合理、培养速度等方面考虑优选三级，第一级培养采用批次补加铵盐的方式，第二级以上培养均采用批次补料和批次换水交替进行的方式，培养过程中定期补加生长促进剂。完成多级放大后收集菌体、浓缩、包装并保存备用。
菌源可以由含有硝化细菌的基质通过富集培养得到。含有硝化细菌的基质来源于天然的土壤、淤泥或含氨工业废水处理厂的活性污泥，或其它一切富含硝化细菌的基质。含硝化菌的基质富集处理可以为本领域现有任何方法，如中国专利200710010383.0中所述的方法。
可以通过定向驯化得到目标菌体含量较高的硝化菌群。如果将硝化反应控制在亚硝酸阶段，则定向驯化培养方法可以选择在高氨氮浓度和高pH值下进行培养，培养过程培养液氨氮初始浓度为100～1000mg/L，最终氨氮浓度为1200～3000mg/L，优选1300～2000mg/L，培养液COD值低于400mg/L，优选低于200mg/L，pH值控制为7.5≤pH≤9.5。
也可以通过梯度稀释纯化法获得重要目的菌株，培养过程为以富集培养得到的菌源为基础，在无菌状态下用灭菌的自配氨氮废水(氨氮浓度100-500mg/L，COD 100mg/L以下)进行梯度稀释提纯，每次稀释1～10倍，对每个稀释倍数在无菌状态下室温(25℃)培养10～40天，对每个培养液利用格利斯试剂测定是否产生了亚硝酸盐氮，最后一个产生亚硝酸盐氮的培养液被认为其中的亚硝酸菌最初都是从一个母细胞分裂而来，结束提纯过程。一般稀释提纯50次以内可以获得最后所需的提纯菌落。
还可以通过平板筛选方法分别从富集培养液中分离出纯度提高的单个菌株，再按照所需的适宜比例组成复合微生物菌群，各个菌体平板筛选方法及所用培养基可以为领域现有的任何可行方法。
还可以通过紫外照射获得硝化能力强、生长速率快的菌株，方法是将菌源制备成菌悬液置于15W的紫外灯下照射5～15秒钟，将处理后的菌悬液再进行固体平板培养基上培养，获得纯度相对较高、硝化能力较强的菌株。
以下以三级为例说明本发明的多级放大培养过程：三级放大培养过程中，第一级采用5～100L小规模培养反应器，第二级培养反应器规模为第一级培养反应器规模的5～20倍，第三级培养反应器规模为第二级培养反应器规模的10～50倍，三级放大培养过程总用时间一般为3～6周。
第一级培养采用在不排水的情况下批次补加铵盐方式，补加铵盐采用适宜浓度的铵盐溶液，当氨氮去除率达到80%以上时，补加氨氮浓度为10-25g/L的铵盐溶液，使得补加铵盐后培养液中的氨氮浓度达到800～1500mg/L。初始反应器内物料为反应器有效容积的20%～60%，当反应器内物料达到反应器有效体积80%以上时终止反应，自然沉降后排出上清液，将菌体转到第二级培养反应器中。
第二级培养和第三级培养采用先批次补加铵盐后批次换水交替进行的方式进行培养。第二级培养的批次补加铵盐和批次换水交替进行1～5次，第三级培养的批次补加铵盐和批次换水交替进行2～6次。第二级培养的初始体积和初始氨氮浓度与第一级培养反应器终止时的体积和氨氮浓度相同，当氨氮去除率达到80%以上时补加铵盐溶液，使得补加铵盐后培养液中的氨氮浓度达500～1500mg/L。当硝化反应产物累计浓度达3000-6000mg/L时，停止曝气待自然沉降后排出上清液，保留菌体，加入与排出液同体积的反应液继续反应，直到反应液体积达到反应器容积的80%以上时将菌体转入下一级进行培养。第三级培养方法与第二级培养方法相同，完成三级放大后结束一个批量的生产过程，收集保藏菌体。采用该过程可以得到耐受能力强、硝化效果好的微生物菌群，可以直接用于高氨氮废水的处理，也可以加入保护剂后保藏备用。
培养过程中使用的生长促进剂包含Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+这四种金属阳离子，可采用常用物质进行配置，四种金属阳离子的摩尔配置比例为1∶(4-8)∶(5-15)∶(1-5);其中Fe2+是以FeSO4·7H2O或者FeCL2的形式加入;Mg2+是以MgSO4·7H2O或者MgCL2的形式加入;K+是以KH2PO4和/或K2HPO4的形式加入;Ca2+是采用CaCO3或者CaCl2的形式加入。生长促进剂每12～48小时补加一次。使用生长促进剂能够使硝化细菌的生长速率提高10%-30%(以生物量的干重来计)。
本发明所用的培养液可以是自配含氨废水或者实际氨氮废水，培养液中的氨氮浓度为200mg/L～3000mg/L，COD值低于500mg/L，优选低于300mg/L，最优低于200mg/L。所述批量生产条件：pH值为7.4～9.5，优选7.8～8.5;温度为10℃～40℃，优选20℃～35℃;DO(溶解氧)只要控制在能够保证硝化反应正常进行的范围内即可。第一级培养时，接种物按照MLSS(悬浮固体含量)为0.3～1.5g/L来投加，与活性污泥混合使用时，接种物按照MLSS为0.5～1.0g/L投加，活性污泥的接种量为生物反应器有效容积的10%～50%投加。铵盐为任意可溶性铵盐，如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸氢铵、碳酸铵、醋酸铵等中的一种或几种。
本发明所用的培养反应器可以是各种适宜结构，只要有良好的曝气系统，可以采用搅拌器搅拌也可以不需搅拌。pH值可以通过添加碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或氢氧化钠溶液等进行调节。
上述放大培养的菌体浓缩后得到浓度较高的菌悬液，将这些菌悬液加入营养液或者营养液和保护剂的混合液后可以制备成液态菌剂，也可以利用本领域现有的方法制备成干粉状的菌剂。可以采用塑料袋、塑料瓶或者塑料桶等耐储存、防冻、便于运输等材质的容器或者设备进行包装。包装方法采用本领域现有常规技术，包装量为50～5000g/包(袋或者瓶)包装后的菌剂可以根据具体情况在室温或者低温条件下保存。室温保存保质期为1～6个月，低温保存保质期为1～5年，保存后活性降低率小于10%。
本发明所用的浓缩方法可以通过自然沉降、离心或者过滤等不影响菌体活性的方法。
本发明微生物菌剂使用性能好;生产方法采用多级放大培养过程，不同的培养阶段优化不同的培养方式和条件，获得了综合优化效果，放大速度快，生产量大。本发明方法所生产的微生物菌剂特别适合处理催化剂、合成氨等过程中产生的高浓度含氨废水，该微生物菌剂耐受性和适应性强，抗冲击性好，氨氮的去除负荷高、处理效果好。经过一定时间保藏的微生物菌剂恢复速度快，活性高，可实现脱氨氮微生物的产业化、商品化。
本发明的特点是：微生物菌剂主要由硝酸菌(Nitrobacter sp)、亚硝酸菌(Nitrosomonas sp.)反硝化菌(Denitrobacter sp.)等3种菌株组成，同时可能存在微量其它菌。在含氮废水处理过程中，特别是以短程硝化为主的微生物处理过程中，使用单独的某类菌并不能获得突出的使用效果。实验表明，本发明微生物菌剂中数种不同种类的微生物菌互相配合、促进，使得废水处理效果明显提高。
本发明菌剂制备过程首先通过富集培养获取菌源，根据废水的实际情况采用定向驯化等方法对菌源进行纯化以提高目标菌株在生物群中的数量，将纯度较高的复合微生物投加到生物反应器中逐级进行三级放大培养;培养过程采用批次补料和批次排水交替进行的方式一方面可以节约用水，另一方面可以使微生物菌群具有较强的耐受能力并具有较高的硝化活性。批量生产过程定期补加生长促进剂，可以补充硝化细菌生长所需的矿物质，同时加速酶的硝化反应，增强菌体的耐受性和生化活性。完成三级放大后收集菌体，浓缩后进行包装，所用的营养液可以使菌体保存时间长。