申请日2009.11.19
公开(公告)日2010.05.05
IPC分类号C12N1/00; C02F101/38; C02F101/36; C02F3/34
摘要
本发明提供了一种工业废水降解微生物菌株的培养方法，属于生物技术领域。它解决了现有的用于降解工业废水的菌株降解作用单一，对复合污染物不具降解能力的问题。本工业废水降解微生物菌株的培养方法，包括以下步骤：配制含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基;获取分别以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株;驯化培养和进行质粒及降解能力鉴定;纯化获得含质粒的工业废水降解微生物菌株。本发明的培养方法工艺流程简单，使用原料的成本较低，培养的菌株对复合污染物具有降解能力，对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物降解效率较高。
权利要求书
1.一种工业废水降解微生物菌株的培养方法，该方法包括以下步骤：
A、针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物，分别配制含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基，其中苯胺和硝基苯类化合物以其为唯一的碳源和氮源，苯酚另外添加氮源，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要的其它化学基质成分，将部分液体培养基转化成选择性固体培养基;
B、将工业废水中的活性污泥加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，然后接种到含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基进行驯化培养，培养温度为15-45℃，培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，将驯化培养的菌株涂布于选择性固体培养基进行平板划线分离，并进行质粒抽提，获取分别以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株;
C、将假单胞菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后将其制成感受态细胞，将步骤B中得到的三种质粒菌株和所述的感受态细胞重悬于LB液体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时;再加入到含不同浓度梯度的三种目标化合物的液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为15-45℃，驯化培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时，然后进行质粒及降解能力鉴定;
D、将步骤C中获得菌株进行纯化后，即获得含质粒的工业废水降解微生物菌株。
2.根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤A中所述的苯酚液体培养基中的氮源为浓度为500mg-1500mg/L硝酸铵或浓度为500mg-1500mg/L蛋白胨中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤A中所述的液体培养基中其它化学基质组分为：硝酸钾：0.5-1.5g/L;氯化钠：0.1-1g/L;K2HPO4·3H2O：0.2g-0.8g/L;MgSO4·7H2O：0.2g-0.8g/L;FeSO4·7H2O0.005-0.015g/L。
4.根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤B中驯化培养的培养温度为20-40℃，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
5.根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤C中在LB液体培养基中孵育温度为15-35℃，孵育时间为12-36小时。
6.根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤C中驯化培养的培养温度为20-40℃，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
7.根据权利要求1或5或6所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤C中菌株涂布于选择性固体培养基孵育温度为15-35℃，孵育时间为12-36小时。
说明书
一种工业废水 降解微生物菌株的培养方法
技术领域
本发明涉及一种微生物菌株的培养方法，具体地说涉及一种工业废水降解微生物菌株的培养方法;属于生物技术领域。
背景技术
工业废水污染是治理当前生态保护中一项非常重要和极具挑战性的工作。来自印染、制药、农药、制革、石油化工和食品工业等生产过程中的有机废水成分复杂、可生化性差，严重污染水环境，甚至将削弱水生生物等的长期繁殖能力。现有的工业废水的净化处理技术可归纳为生物法、化学法、物理-化学耦合法和物化-生物耦合法等。其中生物法具有经济性好，无二次污染等优点。
现有的工业废水中对环境污染严重的主要有苯酚、苯胺和硝基苯类化合物等。其中苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、纺织等工业废水中的主要污染物。硝基苯类化合物广泛应用于农药、染料、炸药、橡胶以及其它化工产品的生产。环境中的硝基苯类污染物主要包括硝基苯、硝基氯苯、硝基甲苯、硝基苯酚、硝基苯胺等化合物。利用微生物降解苯酚、苯胺和硝基苯类化合物是一种既经济且不会产生二次污染的方法，近年来，从工业废水污染的环境中分离到许多可以降解苯酚、苯胺和硝基苯类化合物的微生物菌株。盛连喜等人在应用生态学报，2007年7月，第18卷，第7期中对硝基苯类化合物微生物降解研究进展，并从硝基苯类化合物降解菌的驯化筛选，降解途径、降解激励、共代谢、趋化性和分子遗传学角度，阐述了硝基苯类化合物生物降解的最近研究进展。温洪宇等人在徐州师范大学学报(自然科学版)2003年12月，第21卷，第4期中叙述了降解苯酚细菌的分离及生理学特性研究，虽然它通过菌株培养、驯化与筛选从工业废水中分离出两株可以降解苯酚的细菌，但是该菌株仅仅对苯酚具有降解作用，对工业废水中同时具有苯胺和硝基苯类化合物的复合污染物却不具有降解能力。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，提供一种对复合污染物具有降解能力的工业废水降解微生物菌株的培养方法。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的：一种工业废水降解微生物菌株的培养方法，该方法包括以下步骤：
A、针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物，分别配制含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基，其中苯胺和硝基苯类化合物以其为唯一的碳源和氮源，苯酚另外添加氮源，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要的其它化学基质成分，将部分液体培养基转化成选择性固体培养基;
B、将工业废水中的活性污泥加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，然后接种到含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基进行驯化培养，培养温度为15-45℃，培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，将驯化培养的菌株用选择性固体培养基进行平板划线分离，并进行质粒抽提，获取分别以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株;
C、将假单胞菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后将其制成感受态细胞，将步骤B中得到的三种质粒菌株和所述的感受态细胞重悬于LB液体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时;再加入到含不同浓度梯度的三种目标化合物的液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为15-45℃，驯化培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时，然后进行质粒及降解能力鉴定;
D、将步骤C中获得菌株进行纯化后，即获得含质粒的工业废水降解微生物菌株。
本发明针对废水中污染物的种类，采用含不同污染物种类的液体培养基对活性污泥微生物进行驯化培养，再采用平板分离法获取可以污染物为唯一碳源、氮源和能源的含质粒细菌。再加入感受态的宿主菌，采用不同浓度的废水进行驯化，促进质粒转移，并选择优势菌种，纯化后最终得到具有复合污染物降解能力的含质粒的微生物菌种。
其中步骤A中配制不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基，主要配制目标化合物的浓度为0，0.5g/L，1.0g/L，1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L。不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基可以统计出工业废水降解微生物菌株随目标化合物浓度变化的生长变化情况以及对目标化合物的降解率;微生物菌种生长所需要的其它化学基质成分主要有磷、铁、钾、氧、钠、氯、钙、镁等元素。将部分液体培养基添加15-20g琼脂(按1000ml水计算)后就转化成选择性固体培养基。
步骤B中采用的是常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养基的配方为牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，琼脂15克，水1000ml。采用分子生物学方法进行质粒抽提，主要通过离心集菌、碱裂解、酚抽提或氯化铯加溴化乙锭离心后用乙醇沉淀得到以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株。
步骤C中的假单胞菌株(Pseudomonas)主要是恶臭假单胞菌株，将它接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。然后将细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL的三种含质粒菌株及细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL的感受态细胞重悬于LB液体培养基中，其中LB液体培养基用来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。LB液体培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L;酵母提取物(Yeast extract)5g/L;氯化钠(NaCl)10g/L;用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4。
步骤D中采用划线平板分离法对获得菌株进行纯化。
在上述的工业废水降解微生物菌株的培养方法中，步骤A中所述的苯酚液体培养基中的氮源为浓度为500mg-1500mg/L硝酸铵或浓度为500mg-1500mg/L蛋白胨中的一种。在苯酚液体培养基中加入浓度为500mg-1500mg/L硝酸铵或浓度为500mg-1500mg/L蛋白胨作为氮源可以提高菌株对苯酚的降解效率，其中加入浓度为500mg-1500mg/L蛋白胨降解效率高于加入浓度为500mg-1500mg/L硝酸铵。
在上述的工业废水降解微生物菌株的培养方法中，步骤A中所述的液体培养基中其它化学基质组分为：硝酸钾：0.5-1.5g/L;氯化钠：0.1-1g/L;K2HPO4·3H2O：0.2g-0.8g/L;MgSO4·7H2O：0.2g-0.8g/L;FeSO4·7H2O 0.005-0.015g/L。
作为优选，步骤B中驯化培养的培养温度为20-40℃，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
作为优选，步骤C中在LB液体培养基中孵育温度为15-35℃，孵育时间为12-36小时。
作为优选，步骤C中驯化培养的培养温度为20-40℃，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
作为优选，步骤C中菌株涂布于选择性固体培养基孵育温度为15-35℃，孵育时间为12-36小时。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明的培养方法获得的菌株对复合污染物具有降解能力，应用比较方便且范围较广，便于进行大规模的工业化推广。
2、本发明的培养方法工艺流程简单，使用原料的成本较低，培养的菌株对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物降解效率较高。